Desarrollo y validación de ensayo ELISA indirecto utilizando anticuerpos policlonales de gallina anti-suero de pingüino papúa (Pygoscelis papua) : aplicación para la evaluación de seroprevalencia y monitoreo de patógenos virales en pingüinos antárticos

Abstract

El continente antártico presenta una biodiversidad amplia, tanto de especies animales como de microorganismos. Entre ellas, las aves destacan por su potencial movilización de patógenos, asociada a sus patrones migratorios estacionales, lo que puede conllevar la diseminación de bacterias, parásitos y virus desde diferentes latitudes del mundo hacia la Antártida y viceversa, superando las barreras geográficas. Los pingüinos antárticos corresponden a una familia de aves acuáticas de características gregarias y no migratorias, al ser circumpolares, lo que los hace particularmente vulnerables a patógenos introducidos por otras especies. En este contexto, virus ARN como la influenza aviar de alta patogenicidad H5N1 y el virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV), ambos reportados en aves silvestres y migratorias, representan un riesgo creciente para la salud de las colonias de pingüinos antárticos. De hecho, ya se ha reportado la presencia de H5N1 en la Antártida, con registros de mortalidad en diversas especies, incluyendo pingüinos del género Pygoscelis, demostrando su potencial efecto devastador en fauna antártica. Los estudios virológicos en fauna antártica se han basado principalmente en técnicas moleculares que buscan detectar el genoma viral, existiendo un déficit de estudios serológicos que permitan evaluar la exposición previa a infecciones. Esta limitación se deriva de la falta de herramientas moleculares específicas para la investigación en fauna antártica y, por ende, en pingüinos. Para abordar esta brecha de información, el presente trabajo de Tesis propone el desarrollo de un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), utilizando anticuerpos policlonales de gallina específicos contra suero de pingüino papúa, con la finalidad de establecer una plataforma de monitoreo de patógenos virales en pingüinos antárticos del género Pygoscelis. La hipótesis que guio este trabajo fue la siguiente: ‘‘La técnica de ELISA indirecto, desarrollada con anti-suero de pingüino papúa, permite evaluar la seroprevalencia de virus de la influenza aviar de alta patogenicidad H5N1 y virus de la bronquitis infecciosa aviar en pingüinos del género Pygoscelis’’. Se trabajó alrededor de los siguientes objetivos específicos: 1) Desarrollar y validar la técnica de ELISA indirecto, basado en anticuerpos policlonales de gallina anti-suero de pingüino papúa, para la detección de suero de pingüino Pygoscelis. 2) Aplicar el ensayo ELISA indirecto desarrollado para evaluar la seroprevalencia de virus de la influenza aviar de alta patogenicidad H5N1 y virus de la bronquitis infecciosa aviar, en suero de pingüinos del género Pygoscelis. Como resultado, se estableció y validó un sistema ELISA específico para detectar suero de pingüino, obtenida gracias al desarrollo del primer anticuerpo específico anti-pingüino reportado hasta la fecha. Esta herramienta pionera permitió evaluar, por primera vez mediante serología género-especifica, la exposición de pingüinos Pygoscelis a los virus H5N1 e IBV, obteniéndose resultados negativos de seroprevalencia, lo cual concuerda con la evidencia bibliográfica actual. No obstante, el desarrollo de esta plataforma abre nuevas posibilidades para implementar vigilancia activa y continua, con potencial para ser utilizada en la evaluación de exposición ante otros patógenos virales relevantes en la salud de la fauna antártica. Este avance representa un aporte significativo a la comprensión de la respuesta inmune de pingüinos antárticos, y sienta nuevas bases para futuras estrategias de monitoreo en aves silvestres del continente blanco.

Antarctica harbors a wide biodiversity, including both animal species and microorganisms. Among them, birds stand out due to their potential role in the movilization of pathogens, associated with their seasonal migratory patterns. This can lead to the spread of bacteria, parasites, and viruses from different global latitudes to Antarctica and viceversa, overcoming natural geographic barriers. Antarctic penguins are highly gregarious and non-migratory seabirds. These traits make them particularly vulnerable to pathogens introduced by other species. In this context, RNA viruses such as highly pathogenic avian influenza (H5N1) and infectious bronchitis virus (IBV), both reported in wild and migratory birds, pose an increasing risk to the health of penguin colonies. Indeed, the presence of H5N1 has already been reported in Antarctica, with documented mortality in several native species, including penguins of the genus Pygoscelis, demonstrating its potentially devastating impact on Antarctic wildlife. Most virological studies in Antarctic fauna have relied primarily on molecular techniques aimed at detecting viral genomes, resulting in a significant lack of serological studies that could assess prior exposure to infections. This limitation is largely due to the absence of species-specific molecular tools for Antarctic wildlife research, particularly in penguins. To address this knowledge gap, the present thesis aimed to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using chicken-derived polyclonal antibodies specific to gentoo penguin serum, with the goal of establishing a platform for monitoring viral pathogens in Antarctic penguins of the genus Pygoscelis. The study was guided by the following hypothesis: "An indirect ELISA assay developed with anti-gentoo penguin serum, allows for the assessment of the seroprevalence of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) and avian infectious bronchitis virus (IBV) in penguins of the genus Pygoscelis’’. To test this hypothesis, two specific objectives were addressed: (1) To develop and validate an indirect ELISA technique based on chicken polyclonal antibodies against gentoo penguin serum, for the detection of Pygoscelis penguin serum; and (2) To apply the developed indirect ELISA to evaluate the seroprevalence of H5N1 and IBV in penguins of the genus Pygoscelis. As a result, a specific and validated ELISA system was established for penguin serum detection, made possible through the development of the first penguin-specific antibody reported to date. This pioneering tool enabled, for the first time, genus-specific serological evaluation of Pygoscelis penguins’ exposure to H5N1 and IBV viruses, revealing negative seroprevalence for both, which aligns with the current literature evidence. Nevertheless, the development of this platform opens new possibilities for implementing active and continuous surveillance, with the potential to be used in the assessment of exposure to other viral pathogens relevant to Antarctic wildlife health. This advancement represents a significant contribution to understanding the immune response of Antarctic penguins and lays new groundwork for future epidemiological monitoring strategies in wild birds of the white continent.