Inclusión de nanopartículas de oro en vesículas extracelulares aisladas de células de melanoma B16F10 que expresan caveolina-1, como estrategia para el direccionamiento y acumulación preferencial en tumores metastásicos de pulmón en un modelo murino

Abstract

El desarrollo de terapias contra el cáncer ha constituido un verdadero desafío, debido a distintos factores como la resistencia a los fármacos y la baja selectividad de los principios activos para alcanzar sus blancos terapéuticos. Por otro lado, el tratamiento es aún menos eficaz cuando las células tumorales adquieren la capacidad de invadir otros tejidos, proceso denominado metástasis, para el cual generalmente no existe cura. Existen modelos de metástasis en animales para su estudio, entre ellos el uso de células de melanoma murino B16F10 constituye un modelo interesante por su gran potencial metastásico y su capacidad de colonizar de forma selectiva a los pulmones de ratones C57BL/6. En este sentido, se ha evidenciado que vesículas extracelulares derivadas de células B16F10 tienen tropismo por los nódulos metastáticos de pulmón generados a partir de las células B16F10. Las vesículas extracelulares (EVs) son una población heterogénea de vesículas de membrana derivadas de células. Las EVs se han dividido clásicamente en tres tipos principales en función de su biogénesis y propiedades biofísicas: exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos. Las EVs son portadoras de diversas moléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, y median en la comunicación entre células tanto en circunstancias fisiológicas como patológicas. Los exosomas son las EVs más pequeñas (30-150 nm), de origen endocítico y son liberadas al medio extracelular desde los cuerpos multivesiculares intracelulares (MVB) por diversos tipos de células, incluidas las células cancerosas. Así, las EVs han demostrado gran potencial como vehículos para terapia dirigida, debido a sus propiedades naturales como biocompatibilidad, capacidad de atravesar barreras biológicas y su organización de membrana similar a la célula de origen, lo que facilita su acumulación y captación en tejidos específicos en las que se encuentren dichas células de origen, mejorando así la selectividad de entrega de carga. Existen métodos directos de carga de EVs incluyendo a la electroporación, la carga pasiva por difusión, el choque térmico y la sonicación. Sin embargo, se ha descrito una metodología para carga indirecta de EVs en la cual se promueve la captación celular de diferentes moléculas o nanopartículas y su tráfico a través de la vía endocítica para la posterior liberación en el interior de las vesículas. De esta manera se conserva la estructura y propiedades de direccionamiento de estas EVs. Caveolina 1 (CAV1) es una proteína de membrana y principal componente estructural de las caveolas en la membrana plasmática y que ha presentado un papel controversial en la patología de cáncer. Se ha reportado que CAV1 regula la endocitosis, la exocitosis, la transducción de señalización y en los últimos años, se ha evidenciado que CAV1 también puede secretarse ya que puede incluirse en las vesículas extracelulares donde desempeña un papel importante en el sorting o determinación de la composición de la carga. De esta manera si CAV1 está presente en células de cáncer cambia la carga proteica de las vesículas extracelulares promoviendo migración/invasión de las células de cáncer receptoras, posiblemente por transferencia de proteínas de adhesión celular11. Además, este rol de CAV-1 en el sorting de carga proteica de las vesículas extracelulares es al menos parcialmente dependiente de su fosforilación en tirosina 14 (Y14), ya que las EVs derivadas de células B16F10 que expresan un mutante fosfomimético de CAV1 (CAV1/Y14E) están enriquecidas en proteínas de adhesión celular, como las integrinas αvβ3 y β5, en comparación con las EVs derivadas de células que expresan CAV1 no fosforilable (CAV/Y14F)11 Las nanopartículas son agentes con una dimensión menor a 100nm que varían en forma, tipo de material y propiedades fisicoquímicas. Entre ellas, son de nuestro interés las nanopartículas de oro (AuNPs) por sus propiedades, destacando su naturaleza estable, fácil síntesis y gran área superficial para la conjugación de drogas aumentando su solubilidad y estabilidad. Además, las nanopartículas de oro son agentes teranósticos que se han incluido en EVs para aplicaciones de entrega de fármacos y diagnóstico de tumores. Las nanopartículas esféricas de oro (AuNPs) destacan por sus propiedades físico químicas que por su tamaño nanométrico pueden ser utilizados en el marcaje de células y EVs para su posterior seguimiento in vitro e in vivo. Se han ensayado diversas estrategias para conjugar la superficie de las nanopartículas con diferentes agentes de targeting, como aptámeros de anticuerpos o determinados péptidos. A pesar de estos esfuerzos, la eficacia de la administración sigue siendo pobre, en torno al 1 %, sólo ligeramente superior a la administración mediada por EPR. Por esta razón, en un estudio anterior, demostramos que las EVs derivadas de células cancerosas pueden utilizarse como vectores efectivos para aumentar la liberación de nanopartículas de oro hacia los nódulos metastásicos. Por lo tanto, decidimos estudiar la biodistribución de las EVs derivadas de células B16F10 teniendo en cuenta que la expresión de CAV1 y su fosforilación en Y14 alteran el contenido proteico de las EVs, aumentando la presencia de integrinas, como αvβ3 y β5, que pueden potenciar la orientación de las EVs hacia los nódulos metastásicos generados por sus células parentales. Basado en los antecedentes descritos, se plantea la siguiente hipótesis: La expresión de Caveolina-1 y su fosforilación el tirosina 14 (Y14) en las células B16F10 potencian el direccionamiento y acumulación preferencial de sus vesículas extracelulares cargadas con nanopartículas de (AuNPs) hacia pequeños tumores metastásicos de pulmón. Mediante el desarrollo de este proyecto de tesis se obtuvo el nanosistema EVs(CAV1)-AuNPs, al utilizar un protocolo de inclusión indirecta de nanopartículas de oro conjugadas con ácido fólico (FA), con el fin de promover su internalización en las células B16F10 que expresen CAV1 y su tráfico a través de la vía endocítica, con liberación posterior de nanopartículas en el interior de las vesículas, sin que estas afecten su tropismo natural. Desarrollado el nanosistema, se determinó su internalización y selectividad hacia células de melanoma murino B16F10 y células fibroblastos de pulmón MLg in vitro mediante citometría de flujo y microscopia de fluorescencia. Adicionalmente, se realizó un estudio de la biodistribución tras la administración del nanosistema EVs(CAV1)-AuNPs y su control EVs(Mock)-AuNPs en un modelo de metástasis pulmonar in vivo mediante fluorescencia NIR, análisis de oro cuantitativo y análisis histológico de los pulmones. En relación a este estudio de biodistribución de los nanosistemas in vivo se observó direccionamiento y acumulación preferencial del nanosistema EVs(CAV1)-AuNPs hacia los pulmones y tumores metastásicos de pulmón en comparación con su control EVs(Mock)-AuNPs. Finalmente, se evaluó la biodistribución de las EVs mutantes EVs(CAV1/Y14F)-AuNP y EVs(CAV1/Y14E)-AuNP en el modelo de metástasis pulmonar, observándose también una acumulación preferencial de EVs(CAV1/Y14E)-AuNP (mutante fosfomimética) en nódulos metastásicos de pulmón en comparación con EVs(CAV1/Y14F)-AuNP (mutante no fosforilable). Una vez concluido este trabajo demostramos el potencial uso de vesículas extracelulares que contengan CAV1, como vehículos que mejoren la selectividad de entrega de nanopartículas de oro hacia nódulos metastásicos, proporcionando así un nanosistema con potencial teranóstico para cáncer.

The development of cancer therapies has been a real challenge, due to different factors such as drug resistance and the low ability of chemotherapeutics drugs to selectively reach their therapeutic target. On the other hand, treatment is even less effective when tumor cells acquire the capacity to invade other tissues, a process called metastasis, for which there is generally no cure. There are animal models of metastasis for in vivo preclinical studies, among which the use of murine B16F10 melanoma cells models are of particular interest model due to their great metastatic potential and their ability to selectively colonize the lungs of C57BL/6 mice. In this regard, it has been shown that extracellular vesicles (EVs) derived from B16F10 cells have tropism for metastatic lung nodules generated from B16F10 cells. Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of cell-derived membrane vesicles. EVs have been classically divided into three main types based on their biogenesis and biophysical properties: exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. EVs are vehicles for various molecules, such as proteins, nucleic acids and lipids, and mediate cell-to-cell communication in both physiological and pathological circumstances. Exosomes are the smallest EVs (30-150 nm), of endocytic origin and are released into the extracellular environment from intracellular multivesicular bodies (MVBs) by various cell types, including cancer cells. Thus, EVs have demonstrated great potential as vehicles for targeted therapy, due to their natural properties such as biocompatibility, ability to cross biological barriers and their membrane organization similar to origin cell, which facilitates their accumulation and uptake in specific tissues where the cells of origin are located, thus improving the selectivity of cargo delivery. There are direct methods of EV loading including electroporation, passive diffusion loading, heat shock and sonication. However, a methodology for indirect loading of EVs has been described in which the cellular uptake of different molecules or nanoparticles and their trafficking through the endocytic pathway for subsequent release inside the vesicles is promoted. In this way, the structure and targeting properties of these EVs are preserved. Caveolin 1 (CAV1) is a membrane protein and major structural component of caveolae in the plasma membrane and has presented a controversial role in cancer. CAV1 has been reported to regulate endocytosis, exocytosis, signaling transduction and in recent years, it has been shown that CAV1 can also be secreted and included in EVs where it plays an important role in the EVs cargo sorting. Thus, when CAV1 is present in cancer cells it changes the protein composition of extracellular vesicles promoting migration/invasion of recipient cancer cells, possibly by transfer of cell adhesion proteins. Furthermore, this role of CAV-1 in protein cargo sorting of extracellular vesicles is at least partially dependent on its tyrosine 14 (Y14) phosphorylation, since EVs derived from B16F10 cells expressing a phosphomimetic mutant of CAV1 (CAV1/Y14E) are enriched in cell adhesion proteins, such as the integrins αvβ3 y β5, compared to EVs derived from cells expressing non-phosphorylable CAV1 (CAV/Y14F)12. Nanoparticles are agents with a dimension of less than 100 nm that differ in shape, type of material and physicochemical properties. Among them, gold nanoparticles (AuNPs) are of interest to us due to their properties, highlighting their stable nature, easy synthesis and large surface area for drug conjugation, increasing their solubility and stability. In addition, gold nanoparticles are theranostic agents that have been included into EVs for drug delivery and tumor diagnostic applications. Spherical gold nanoparticles (AuNPs) stand out for their physicochemical properties which, due to their nanometer size, can be used in the cells and EVs labeling for subsequent in vitro and in vivo monitoring. Various strategies have been evaluated to conjugate the nanoparticle surface with different targeting agents, such as antibody aptamers or certain peptides. Despite these efforts, the efficacy of delivery remains poor at around 1%, only slightly higher than EPR-mediated delivery. For this reason, in a previous study, we demonstrated that cancer cell-derived EVs can be used as effective vectors to enhance the delivery of gold nanoparticles to metastatic nodules. Therefore, we decided to study the biodistribution of B16F10 cell-derived EVs considering that CAV1 expression and its phosphorylation at Y14 alter the protein content of EVs, increasing the presence of integrins, such as αvβ3 y β5, which can enhance the targeting of EVs towards metastatic nodules generated by their parental cells. Thus, taking advantage of the natural properties of vesicles isolated from CAV1-expressing B16F10 cells, we anticipated that these may be used as efficient vehicles to target therapeutic and/or imaging agents such as gold nanoparticles to pulmonary metastatic niches in order to facilitate their detection and selective treatment. Based on the background, the following hypothesis is proposed: The expression of Caveolin-1 and its tyrosine 14 (Y14) phosphorylation in B16F10 cells enhance the preferential targeting and accumulation of their extracellular vesicles loaded with nanoparticles (AuNPs) towards small metastatic lung tumors. During the development of this thesis project, the EVs(CAV1)-AuNPs nanosystem was obtained by using a protocol of indirect inclusion of gold nanoparticles conjugated with folic acid (FA), in order to promote their internalization in CAV1-expressing B16F10 cells and their trafficking through the endocytic pathway, with subsequent release of nanoparticles inside the vesicles, without affecting their natural tropism. Once the nanosystem was developed, its internalization and selectivity towards murine B16F10 melanoma cells and MLg lung fibroblast cells in vitro was determined by flow cytometry and fluorescence microscopy. Additionally, a biodistribution study was performed after administration of the EVs(CAV1)-AuNPs nanosystem and its control EVs(Mock)-AuNPs in an in vivo lung metastasis model using NIR fluorescence, quantitative gold analysis and histological analysis of the lungs. In the in vivo nanosystem biodistribution study, preferential targeting and accumulation of the EVs(CAV1)-AuNPs nanosystem to lungs and metastatic lung tumors was observed compared to the control EVs(Mock)-AuNPs. Finally, the biodistribution of EVs(CAV1/Y14F)-AuNPs and EVs(CAV1/Y14E)-AuNPs mutant EVs was assessed in the lung metastasis model, whereby preferential accumulation of EVs(CAV1/Y14E)-AuNPs (phosphomimetic mutant) in lung metastatic nodules compared to EVs(CAV1/Y14F)-AuNPs (non-phosphorylable mutant). Upon the conclusion of this work, it is expected to demonstrate the potential use of CAV1-containing exosomes as vehicles to enhance the selectivity of gold nanoparticle delivery to metastatic nodules, thus providing a nanosystem with cancer theragnostic potential.