Generación de ADNs provirales de VIH-1 portadores del aptámero Corn para la visualización y localización de los transcritos virales en células vivas”

Abstract

En los últimos años, diversas técnicas como la hibridación in situ fluorescente (FISH) o los sistemas de fluorescencia binarios como MS2-GFP han sido ampliamente utilizadas para estudiar la localización subcelular de ARNs específicos. Sin embargo, algunas limitaciones técnicas de estos métodos dificultan su aplicación para la visualización en tiempo real de estas moléculas. Es en este contexto que los aptámeros de fluorescencia de ARN (FLAPs, por sus siglas en inglés) han surgido como una herramienta prometedora para visualizar ARNs a lo largo del tiempo en células vivas. Los aptámeros son secuencias sintéticas cortas de ARN que adoptan una estructura tridimensional específica, permitiéndoles interactuar con moléculas fluorogénicas con una muy alta afinidad, lo que induce la activación de estas moléculas y la posterior emisión de fluorescencia. Esta propiedad permite realizar un seguimiento espacio-temporal de los transcritos de ARN que presenten este aptámero en su secuencia, resultando crucial para estudiar la dinámica, localización y compartimentalización de los ARNs en tiempo real. El objetivo de esta investigación fue evaluar el uso del FLAP Corn acoplado al fluorógeno DFHO para el seguimiento de los transcritos del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) en un contexto de infección. Dado que el genoma de VIH-1 está codificado como ARN, el seguimiento temporal de estas moléculas podría proporcionar información valiosa sobre sus dinámicas intracelulares. Para este trabajo se diseñaron 3 diferentes constructos que presentan la secuencia genética de Corn. Estos constructos fueron clonados en el genoma de VIH-1, para luego evaluar distintos parámetros en el contexto celular de infección con estos virus modificados, como los niveles de expresión de ARN y proteínas virales, y los niveles de fluorescencia registrados. Los resultados de estos análisis permitirán evaluar si el sistema Corn-DFHO es aplicable para la visualización y seguimiento de ARN virales. 1

In recent years, various techniques such as fluorescence in situ hybridisation (FISH) and binary fluorescence systems like MS2-GFP have been widely used to study the subcellular localization of specific RNAs. However, some technical limitations of these methods hinder their application for the real-time visualisation of these molecules. It is in this context that fluorescent RNA aptamers (FLAPs) have emerged as a promising tool to visualise RNAs over time in living cells. Aptamers are short synthetic RNA sequences that adopt a specific three-dimensional structure, allowing them to interact with fluorogenic molecules with very high affinity, which induces the activation of these molecules and their subsequent fluorescence emission. This property would allow the space-time tracking of RNA transcripts that contain this aptamer in their sequence, which is crucial to study the dynamics, localisation and compartmentalisation of RNAs in real time. The aim of this research was to evaluate the use of the Corn FLAP paired with the DFHO fluorogen for the tracking of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) transcripts in a context of infection. Since HIV-1 encodes its genetic material as RNA, temporal tracking of these molecules could provide valuable information on their intracellular dynamics. For this work, three different constructs were designed that contain the genetic sequence of Corn. These constructs were cloned into the HIV-1 genome, in order to evaluate different parameters in the context of infection with these modified viruses, such as the levels of RNA and viral protein expression, and the levels of fluorescence detected. The results of these analyses will make it possible to assess whether the Corn-DFHO system is applicable for the visualisation and monitoring of viral RNA. 2