Evaluación de la presencia de Defensina-1 en miel de abeja de la zona centro-sur de Chile mediante un método basado en la extracción en fase sólida y HPLC-FLD

Abstract

Apis mellifera es un organismo social organizado en torno a una abeja reina al interior de las colmenas. Las condiciones particulares al interior de esta favorecen la diseminación de agentes infeccioso, lo que impacta en la salud y población de esta especie. Apis mellifera presenta una serie de estrategias innatas para enfrentar tales amenazas, entre ellas la generación de péptidos antimicrobianos. Uno de estos péptidos es la defensina-1 (Def-1), compuesto por 51 aminoácidos y 5525 Da de masa molecular. En su estructura primaria cuenta con 6 residuos de cisteína que forman 3 puentes disulfuro intracadena, y una gran cantidad de aminoácidos básicos cercanos a su extremo C-terminal, características que determinan la estructura de esta proteína y su actividad contra bacterias Gram positiva. Al momento de depositar el néctar en la colmena para la confección de la miel, A. mellifera le añade pequeñas cantidades de Def-1, siendo un aporte a su capacidad antibacteriana e inmunidad social de la colmena. Esta característica de la miel ha derivado en su uso para el tratamiento de quemaduras, heridas o agentes infecciosos resistentes a antibióticos. Por ello resulta de interés conocer el contenido de este péptido en la miel como parte de su caracterización; lo que requiere contar con métodos analíticos para su cuantificación. Esta información llevaría a otorgarle un valor agregado a las mieles y ayudar a evaluar la inmunidad colectiva de Apis mellifera. En este contexto, la presente tesis presenta el desarrolló un método para cuantificar Def-1 presente en miel, basado en extracción en fase sólida y análisis por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de fluorescencia (HPLC-FLD). Se empleó como patrón Def-1 recombinante previamente obtenida por su expresión en E. coli. Mediante desorción-ionización con láser asistida por matriz acoplado a detector de masas con tiempo de vuelo (MALDI-TOF) se obtuvo una masa del péptido recombinante similar a la esperada basada en su estructura primaria. Se realizó la caracterización del péptido mediante espectroscopía de fluorescencia total para establecer las condiciones para su posterior detección por HPLC-FLD; lo cual arrojó como máximos de excitación/emisión valores de 280/360 nm atribuidos al residuo de triptófano presente en su estructura primaria. La concentración de la Def-1 recombinante en la solución stock (1221 μM) se determinó por cuantificación de sus residuos de cisteína por su reacción con 4-ditiodipiridina (4-DPS). Se desarrolló un programa de elusión en gradiente para HPLC usando una columna C18 (Phenomenex, Aeris peptide ®) el que permitió visualizar el péptido con un tiempo de retención de 4,7 ± 0,2 minutos y construir una curva de calibración con un intervalo lineal entre 1 y 150 μM (R2 = 0,9952). Posteriormente se estableció un método de extracción en fase sólida para extraer la defensina-1 desde la miel basado en intercambio catiónico débil (Waters, HLB-WCX ®). La identificación del pico cromatográfico asociado al péptido en muestras de miel se realizó por fortificación de los extractos obtenidos con defensina-1 recombinante. Se obtuvo un límite de cuantificación de 3,0 μg/g. El método desarrollado se aplicó entonces a 10 mieles chilenas, obteniendo entre 3 y 267 μg de defensina-1 por g de miel (entre 0,3 y 38% de las proteínas totales). Se observó un mayor contenido de defensina en las mieles provenientes de las regiones de Coquimbo y Maule que las de la zona sur.

Apis mellifera is a social organism organized around a queen bee within hives. The particular conditions within the hive favor the spread of infectious agents, impacting the health and population of this species. Apis mellifera exhibits a series of innate strategies to confront such threats, including the generation of antimicrobial peptides. One of these peptides is defensin-1 (Def-1), composed of 51 amino acids and a molecular weight of 5525 Da. Its primary structure includes six cysteine residues that form three intrachain disulfide bridges, and a large number of basic amino acids near its C-terminal end. These characteristics determine the structure of this protein and its activity against Gram-positive bacteria. When depositing nectar in the hive for honey production, A. mellifera adds small amounts of Def-1, contributing to its antibacterial capacity and social immunity. This characteristic of honey has led to its use in the treatment of burns, wounds, and antibiotic-resistant infectious agents. Therefore, it is of interest to understand the content of this peptide in honey as part of its characterization; this requires analytical methods for its quantification. This information would add value to honey and help assess the herd immunity of Apis mellifera. In this context, this thesis presents the development of a method to quantify Def-1 present in honey, based on solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography analysis coupled with a fluorescence detector (HPLC-FLD). Recombinant Def-1 previously obtained from its expression in E. coli was used as a standard. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass detector obtained a recombinant peptide mass similar to that expected based on its primary structure. The peptide was characterized by total fluorescence spectroscopy to establish the conditions for its subsequent detection by HPLC-FLD; which yielded excitation/emission maxima values of 280/360 nm attributed to the tryptophan residue present in its primary structure. The concentration of recombinant Def-1 in the stock solution (1221 μM) was determined by quantification of its cysteine residues by its reaction with 4-dithiodipyridine (4-DPS). A gradient elution program was developed for HPLC using a C18 column (Phenomenex, Aeris peptide ®), which allowed visualization of the peptide with a retention time of 4,7 ± 0,2 minutes and construction of a calibration curve with a linear interval between 1 and 150 μM (R2 = 0,9952). A solid-phase extraction method was subsequently established to extract defensin-1 from honey based on weak cation exchange (Waters, HLB-WCX ®). The chromatographic peak associated with the peptide was identified in honey samples by fortifying the obtained extracts with recombinant defensin-1. A quantification limit of 3,0 μg/g was obtained. The developed method was then applied to 10 Chilean honeys, obtaining between 3 and 267 μg of defensin-1 per g of honey (between 0.3 and 38% of total proteins). A higher defensin content was observed in honeys from the Coquimbo and Maule regions than in those from the southern zone.