Fotofísica de sondas dimetilaminonaftalenos (DAN) y sus derivados rigidizados : cinética de estado excitado, conformaciones y fotoconsumo

Abstract

Los derivados de DAN, y en particular LAURDAN, son sondas fluorescentes ampliamente utilizadas para explorar la estructura, dinámica y transiciones de fase de las membranas. Su marcada sensibilidad a la polaridad y a la hidratación los ha consolidado como herramientas importantes en microscopía de fluorescencia y estudios biofísicos. Sin embargo, recientemente ha emergido una nueva interpretación sobre su fotofísica basada en la presencia de confórmeros diferenciados en la membrana que determinan sus propiedades de emisión. Por otro lado, el fotoblanqueo y la inactivación de LAURDAN son inconvenientes bien conocidos que comprometen las mediciones de fluorescencia, pero no existe en la literatura una descripción sistemática de estos procesos para las sondas basadas en DAN. A pesar del amplio conocimiento y uso de sus propiedades fisicoquímicas, el conocimiento fundamental sobre su fotoestabilidad y sus vías de degradación sigue siendo limitado. En este trabajo, se estudió derivados de DAN con diferente flexibilidad del grupo acilo, con la intención de simular los confórmeros de la sonda en la membrana. Los resultados en medio homogéneo muestran que el comportamiento fluorescente depende fuertemente del disolvente, observándose que los derivados rigidizados presentan una emisión aumentada en medios polares próticos. En cambio, en medio heterogéneo, se observó una respuesta comparable a las transiciones lipídicas entre derivados rigidizados y no rigidizados, sugiriendo que la rotación de la cadena acilada no influye significativamente en la respuesta al entorno. Por otro lado, estudios de fotosensibilización indican que las sondas DAN presenta el mayor rendimiento de generación de oxígeno singulete en solventes apolares. Los estudios de fotodescomposición realizados con LAURDAN revelaron una estabilidad dependiente del disolvente, con un fotoblanqueo extenso en acetonitrilo, pero solo una degradación moderada en etanol y tolueno. El análisis por HPLC mostró la formación de múltiples fotoproductos, algunos de los cuales conservaron características cromofóricas. Estos resultados proporcionan la primera descripción sistemática de la degradación de sondas DAN, aportando un conocimiento valioso para su aplicación fiable y la interpretación de su comportamiento en investigaciones de membranas y en imágenes de fluorescencia.

DAN derivatives, and particularly LAURDAN, are widely used fluorescent probes to explore membrane structure, dynamics, and phase transitions. Their pronounced sensitivity to polarity and hydration has established them as important tools for fluorescence microscopy and biophysical studies. Recently, a new interpretation of DAN fluorescence was suggested based on the presence of rotamers of the probe within the membrane. On the other hand, photobleaching and probe inactivation are well-known drawbacks that compromise fluorescence measurements, yet no systematic description of these processes exists in the literature for DAN-based probes. Despite the extensive physicochemical understanding and usage, fundamental knowledge about their photostability and degradation pathways remains limited. In this work, we studied DAN derivatives having restricted acyl group flexibility with the aim of simulating the conformers of the probe withing the membrane. Our results in homogeneous media show that fluorescence behavior strongly depends on the solvent, with rigidized derivatives showing enhanced emission in polar protic media. In heterogeneous media, a comparable response to membrane phase transition was observed between rigidized and non-rigidized derivatives, suggesting that rotamers do not alter the response significantly. All compounds exhibited enhanced photosensitization in apolar solvents. Photodecomposition studies with LAURDAN revealed solvent-dependent stability, with extensive bleaching in acetonitrile but only modest degradation in ethanol and toluene. HPLC analysis showed the formation of multiple photoproducts, some retaining chromophoric features. These results provide the first systematic description of DAN probe degradation, offering important knowledge for their reliable application and interpretation of their behavior in membrane research and fluorescence imaging.