Rol de la proteína tirosina cinasa SRC en la actividad del hemicanal panexina 1 inducida por NMDA en un modelo de dolor crónico neuropático en rata

Abstract

El dolor crónico es un problema de salud pública y pese a los avances en tecnología farmacéutica y el desarrollo de fármacos, a la fecha no existe una terapia efectiva para tratar el dolor crónico. Los cuadros de dolor crónico se caracterizan por alteraciones de la percepción de dolor como la hiperalgesia y la alodinia generadas entre otros factores por una potenciación de la sinapsis nociceptiva espinal, debido a la fosforilación de receptores, modificación de la sensibilidad de los receptores, incremento en la liberación de neurotransmisores, liberación de nuevas moléculas activas, activación de las microglias y astrocitos, etc. El conjunto de estas modificaciones se conoce como sensibilización central. La activación del receptor de NMDA es ampliamente reconocida como un mecanismo esencial para el desarrollo y mantención del dolor crónico. Estudios realizados en modelos de dolor crónico se ha asociado la activación del receptor de NMDA con un aumento de la fosforilación de la proteína tirosina cinasa Src, mientras que en neuronas del hipocampo se ha mostrado una interacción entre el receptor NMDA y el hemicanal formado por Panexina-1 (Panx1) vía proteína tirosina cinasa Src. Asimismo, trabajos previos desarrollados por nuestro laboratorio han demostrado una interacción entre el receptor NMDA y el hemicanal Panx1, en la cual la activación del hemicanal Panx1 parece ser necesaria para el efecto del receptor NMDA. Sin embargo, la interacción molecular y el mecanismo por el cual se relaciona el receptor NMDA y el hemicanal Panx1 en dolor crónico no ha sido dilucidado hasta ahora. En conjunto estos antecedentes nos conducen a proponer que la activación del receptor NMDA (rNMDA) en el asta dorsal de la médula espinal de ratas con dolor neuropático induce la fosforilación de proteína tirosina cinasa Src y la consecuente activación del hemicanal Panx1. Objetivos Específicos: 1.- Investigar si la hiperalgesia inducida por la activación del receptor NMDA se atenúa por la inhibición de la proteína tirosina cinasa Src o el bloqueo del hemicanal Panx1 en ratas neuropáticas. 2. Evaluar cambios en los niveles de las proteínas Panx1 y pPanx1 en neuronas del asta dorsal de la médula espinal en ratas con dolor neuropático. 3.- Determinar los niveles de las proteínas pSrc-Y416 y pPanx1-Y198, inducidas por la administración del agonista NMDA en la médula espinal de ratas neuropáticas, se modifican al inhibir la proteína tirosina cinasa Src (PP2, inhibidor) o bloquear el hemicanal Panx1 (10panx, bloqueador). 4.- Determinar si la activación del rNMDA modula la actividad del hemicanal Panx1 a través de la fosforilación de la proteína tirosina cinasa Src en el asta dorsal de la médula espinal de ratas neuropáticas. 7 días post escisión del nervio Sural, se les administró el agonista exógeno del rNMDA (NMDA), inhibidor de tirosina cinasa Src (PP2), PP3 (control negativo de PP2), bloqueadores del hemicanal Panx1 como carbenoxolona (CBX) y péptido 10panx, Scrambled 10Panx (Scr10Panx), en diferentes grupos de ratas Sprague Dawley. Para determinar la posible participación de la proteína tirosina cinasa Src en la funcionalidad in vivo del hemicanal Panx1 se administró por vía i.t. inhibidores de la proteína tirosina cinasa Src seguido de NMDA en ratas neuropáticas, y la alodinia mecánica fue evaluada cada 30 min por 240 min después de la administración de ambos tratamientos. La administración de PP2- NMDA aumentó el ΔAUC (efecto hipoalgésico) respecto al grupo control Sal- Sal, resultado opuesto a lo obtenido en los animales que recibieron Sal-NMDA, donde el umbral de retiro de la pata de los animales fue - 4.950 ± 313,9 (efecto hiperalgésico). Asimismo, la administración de 10Panx seguido de NMDA (grupo 10Panx-NMDA) indujo un aumento en el ΔAUC (efecto hipoalgésico) y previno el efecto hiperalgésico causada por el agonista endógeno NMDA. Posteriormente, se midieron los niveles de las proteínas Panx1 y pPanx1 en neuronas del asta dorsal de la médula espinal de ratas sham y neuropáticas para establecer si existe un acoplamiento funcional entre el rNMDA y los hemicanales de Panx1. Los resultados obtenidos por inmunofluorescencia mostraron que tanto la proteína Panx1 y su modificación post-transduccional pPanx1-Y198 se co-expresan en neuronas (células NeuN positivas) del asta dorsal de la médula espinal de ratas neuropáticas (198,9 ± 27,3 u.a y 486,2 ± 33,7 u.a). En ratas sham, a pesar de que, se observó co-localización de Panx1 en neuronas (189,9 ± 12,0 u.a), esta expresión no se observó igualmente aumentada en la proteína pPanx1-Y198 (174,6 ± 19,9 u.a) comparada con las rebanadas de ratas neuropáticas. Por otro lado, se determinó que los niveles de la proteína tirosina cinasa Src y Panx1 en animales neuropáticos no presenta cambios estadísticamente significativos respecto a los animales sham. Sin embargo, se encontró un aumento en la expresión del estado fosforilado de Src (pSrc416) en el grupo de ratas que recibió el agonista NMDA (0,40 ± 0,07 y 0,90 ± 0,10, respectivamente), mientras que en el grupo que recibió el inhibidor PP2 se produjo una disminución significativa en los niveles de la proteína pSrc416 (0,32 ± 0,08). La expresión del pPanx1-Y198 fue aumentada al estimular el receptor de NMDA con el agonista endógeno NMDA (0,89 ± 0,13), mientras que la administración del inhibidor PP2 y el bloqueador 10Panx produjeron una disminución en los niveles de la proteína (0,38 ± 0,02 y 0,36 ± 0,09, respectivamente). Los resultados también mostraron que la inhibición de la proteína tirosina cinasa Src provoca una disminución en los niveles de pPanx1-Y198, pero no así de la proteína Panx1. Finalmente, la metodología de captación del colorante YOPRO-1 fue utilizada para determinar tanto la activación del hemicanal Panx1 como su interacción con el rNMDA. Rebanadas provenientes tanto de ratas sham como neuropáticas incubadas con el agonista NMDA incrementa la permeabilidad de las neuronas espinales al colorante YOPRO- 1 (medida en unidades de fluorescencia promedio relativa), a valores de 2,17 ± 0,18 para las ratas sham y de 6,135 ± 0,51 para las ratas neuropáticas. La incorporación YOPRO-1 depende de la activación del rNMDA, dado que la pre-incubación de las rebanadas con el antagonista D.AP5 disminuye la incorporación YOPRO-1 tanto en neurona de ratas sham (1,37 ± 0,16) como neuropáticas (0,93 ± 0,11). La incorporación de YOPRO-1 inducida por la estimulación del receptor NMDA en neuronas espinales de ratas neuropáticas es disminuida al pre-incubar las rebanadas con bloqueadores del hemicanal Panx1 (1,72 ± 0,13 para 10Panx, y 1,81 ± 0,15 para CBX), sugiriendo la participación del hemicanal Panx1 en la incorporación de YOPRO-1. La incorporación de YOPRO-1 en neuronas espinales de ratas neuropáticas también es disminuida al pre-incubar las rebanadas con el inhibidor PP2 de la proteína tirosina cinasa Src (PP2, 1,69 ± 0,2), lo que sugiere la participación de la proteína tirosina cinasa Src en la incorporación de YOPRO-1.