Diferenciación de la generación de peróxido de hidrógeno en miel promovida por glucosa oxidasa y flavonoides

Abstract

La miel es una matriz compleja con propiedades bioactivas que han sido asociadas a su capacidad antioxidante y antimicrobiana, en particular por la generación de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) como principal especie oxidante. Si bien se reconoce que la acción de la glucosa oxidasa (GOx), enzima secretada por las abejas, es la principal responsable de la generación de H₂O₂, como producto secundario de la oxidación de la glucosa, esta generación es igualmente posible por una vía no enzimática que involucra flavonoides y cationes metálicos. Además, estos componentes de la miel igualmente podrían modular la actividad de GOx. Sin embargo, estas complejas interrelaciones han sido poco estudiadas. El presente trabajo tuvo como objetivos diferenciar y cuantificar las dos citadas vías de generación de H2O2 en mieles, estudiar el efecto de los cationes Cu 2+ y Fe 3+ y del flavonoide quercetina sobre la actividad de GOx extraída desde la miel y evaluar las interrelaciones entre los distintos componentes responsables de la generación de H2O2 en miel. Para ello, a partir de 15 muestras de miel se obtuvieron, mediante extracción en fase sólida, una fracción rica en glucosa oxidasa, proteínas y azúcares (FG), y una fracción rica en compuestos fenólicos (FF). En cada una de estas fracciones se evaluaron la generación de H2O2, contenido de proteínas, polifenoles totales (CPT) y flavonoides totales (CFT). Además, se evaluó el efecto de Cu2+, Fe3+ y quercetina sobre la generación de H2O2 de la FG. Finalmente, se utilizó el algoritmo de mínimos cuadrados parciales (PLS) para relacionar la generación de H2O2 en la miel entera con las variables determinadas. La generación de peróxido en las mieles enteras estuvo comprendida entre 5 y 36 μg/g, con un promedio de 14 ± 8 μg/g. Se observó que la fracción FG es la principal responsable de la generación de peróxido, atribuida principalmente al contenido intrínseco de GOx, es decir la vía enzimática, con un valor promedio de 14 ± 9 μg/g miel, mientras que la fracción FF, la cual representa la vía no enzimática, atribuida al efecto prooxidante de compuestos fenólicos, presentó valores considerablemente más bajos (1,7 ± 0,9 μg/g miel), aunque detectables en la mayoría de las muestras. El CFT mostró una correlación significativa con la generación de H2O2 en la fracción FF (R² = 0,418; p < 0,05), lo que sugiere que los flavonoides participan en mecanismos no enzimáticos de producción de H2O2 en esta fracción. En la miel entera (ME), la correlación entre CFT y H₂O₂ fue inicialmente baja, pero aumentó al excluir valores atípicos (R² = 0,54; p < 0,05), lo que indica una posible participación secundaria de los compuestos fenólicos en la generación de peróxido bajo ciertas condiciones. Se observó que, en 9 de las 15 mieles, al menos uno de los tratamientos probados (cationes o quercetina) redujo significativamente los niveles de H₂O₂ de la FG. Así, en 3, 5 y 9 de las 15 muestras (20, 33 y 60%), se observaron reducciones significativas (p < 0,05) de la generación de H2O2 en la fracción FG, por efecto de Cu 2+ (30 μM), Fe 3+ (50 μM) y quercetina (5 μM), respectivamente. Esta acción inhibitoria sobre GOx se produce por mecanismos diferentes (coordinación de cationes con la forma reducida de FADH2 en el sitio activo de GOx y unión directa de quercetina a los residuos de aminoácidos del mismo sitio); siendo mayor por parte de la quercetina que de los cationes. Estos resultados apoyan un modelo mecanístico donde coexisten rutas enzimáticas (GOx) y no enzimáticas para la generación de H2O2, la que puede ser modulada tanto por los metales como los compuestos fenólicos. Finalmente, el modelo PLS para describir la generación de H2O2 en la miel entera evidenció la importancia de la fracción FG sobre esta, atribuible al contenido en GOx, lo que reafirma su papel central en la producción de peróxido. Por otro lado, la fracción FF presentó una relación negativa coherente con la acción antioxidante de los flavonoides. Por otra parte, CFT y CPT se relacionaron inversamente con la generación de H2O2 en la miel entera, mientras que el contenido de proteínas mostró una contribución marginal al modelo. Estos resultados evidencian el papel dual de los compuestos fenólicos, capaces de actuar como moduladores positivos o negativos dependiendo del contexto químico y de la fracción en la que se encuentren. En conjunto, estos hallazgos permiten una mejor comprensión de los factores que determinan la generación del peróxido de hidrogeno en una solución acuosa de miel.