Identificación de N6-metiladenosina en RNAs largos no codificantes que participan en una red de competencia endógena en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por norepinefrina

Abstract

La hipertrofia cardiaca patológica (PCH) inducida por estímulos neurohumorales constituye un proceso complejo que involucra remodelado estructural, reprogramación metabólica y cambios profundos en la regulación génica y postranscripcional. Entre los reguladores emergentes con potencial relevancia biológica destacan los RNA largos no codificantes (lncRNAs) y la modificación epitranscriptómica N6-metiladenosina (m6A), ambos descritos como moduladores de la homeostasis cardiaca y de la respuesta a estrés. Sin embargo, su papel integrado dentro de redes de competencia endógena de RNA (ceRNA) durante la hipertrofia inducida por norepinefrina (NE) no ha sido completamente caracterizado. En este contexto, esta tesis plantea la siguiente hipótesis: “RNAs largos no codificantes diferencialmente expresados y metilados con modificación m6A están involucrados en redes de competencia endógena de RNAs (ceRNAs) en la hipertrofia de cardiomiocitos de rata neonata inducida por norepinefrina”. De esta forma acorde a esta hipótesis, el objetivo general fue: Identificar lncRNAs diferencialmente expresados y metilados que componen una red de ceRNA en cardiomiocitos de rata neonata estimulados con norepinefrina para inducir hipertrofia. Para ello, se abordaron tres objetivos específicos: 1) Identificar lncRNAs y mRNAs diferencialmente expresados en la hipertrofia de cardiomiocitos de rata neonata inducida por norepinefrina; 2) Determinar la participación de lncRNAs diferencialmente expresados en redes de ceRNA en la hipertrofia de cardiomiocitos de rata neonata inducida por norepinefrina, y 3) Identificar modificaciones m6A en lncRNAs diferencialmente expresados que participan en ceRNAs en la hipertrofia de cardiomiocitos de rata neonata inducida por norepinefrina. Para responder esta hipótesis, se estableció un modelo in vitro de hipertrofia mediante la estimulación de cardiomiocitos ventriculares de rata neonata (NRVMs) con NE por 24 horas, validándose el fenotipo hipertrófico mediante análisis morfológico para evaluar área y perímetro celular, qPCR y Western blot de marcadores clásicos como ANP (Nppa), BNP (Nppb), RCAN1 (Rcan1) y β-MHC (Myh7). Posteriormente, se realizó una secuenciación de RNA total (RNA-seq) y de RNAs pequeños (sRNA-seq) para identificar mRNAs, lncRNAs y miRNAs diferencialmente expresados (DE), complementado con análisis de enriquecimiento funcional (Gene Ontology/KEGG) y análisis de correlación de expresión entre lncRNA-mRNA. Para explorar interacciones postranscripcionales se construyeron redes de ceRNAs basas en predicciones in silico de lncRNA-miRNA-mRNA utilizando los programas IntaRNA y miRWalk, y junto con topología de conectividad. Finalmente, se realizó secuenciación directa de RNA (DRS) utilizando la tecnología Oxford Nanopore (ONT), junto con el flujo de trabajo m6Abasecaller/modPhred, para identificar y cuantificar modificaciones del tipo m6A en transcritos relevantes al modelo. Los resultados mostraron que la NE induce una reprogramación transcriptómica global caracterizada por la activación de genes anabólicos y estructurales (como Bcat1, Acnt1) y el cambio a nivel de metabolismo celular y autofagia (como Ulk1, Gpr22), revelando dos módulos funcionales opuestos. En este contexto, se identificaron lncRNAs hubs DE, como ENSRNOT00000165859 (isoforma de ENSRNOG00000086264) en el eje activado y ENSRNOT00000127110 (isoforma de ENSRNOG00000087293) en el eje reprimido. Las redes de ceRNA construidas sugieren que los lncRNAs regulados al alza actúan secuestrando miRNAs anti-hipertróficos (miR-150-5p, miR-708-5p), permitiendo la des-represión de genes de crecimiento como Bcat1; mientras que la represión de lncRNAs protectores liberó miRNAs patológicos (miR-132-3p, let-7c), resultando en el silenciamiento de Ulk1. De manera complementaria, el análisis de m6A reveló una firma epitranscriptómica bimodal altamente coherente: los lncRNAs y mRNAs del eje pro-hipertrófico presentaron hipermetilación (Hyper-m6A), sugiriendo un posible mecanismo de estabilización y la función de ceRNA; inversamente, los transcritos del eje protector sufrieron una pérdida de metilación (hipometilación), consistente con su desestabilización y degradación. En conjunto, estos hallazgos permiten proponer un modelo de Sinergia epitranscriptómica-ceRNA, en el cual la hipertrofia inducida por NE surge de la convergencia jerárquica entre expresión diferencial y modificación m6A, posicionando a los lncRNAs como posibles elementos integradores clave que sostienen el crecimiento celular a expensas de la proteostasis y la autofagia. Este estudio no solo identifica nuevos lncRNAs candidatos con potencial relevancia funcional, sino que establece un marco conceptual integrador que abre oportunidades para validar mecanismos y proyectar aplicaciones terapéuticas basadas en la modulación de la maquinaria epitranscriptómica.

Pathological cardiac hypertrophy (PCH) induced by neurohumoral stimuli is a complex process involving structural remodeling, metabolic reprogramming, and profound changes in gene and post-transcriptional regulation. Among the emerging regulators with potential biological relevance are long non-coding RNAs (lncRNAs) and the epitranscriptomic modification N6-methyladenosine (m6A), both described as modulators of cardiac homeostasis and the stress response. However, their integrated role within endogenous RNA competition (ceRNA) networks during norepinephrine-induced hypertrophy (NE) has not been fully characterized. In this context, this thesis proposes the following hypothesis: “Differentially expressed and m6A-methylated long non-coding RNAs are involved in endogenous RNA competition (ceRNA) networks in norepinephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy in neonatal rats.” Thus, in accordance with this hypothesis, the overall objective was to identify differentially expressed and methylated lncRNAs that comprise a ceRNA network in neonatal rat cardiomyocytes stimulated with norepinephrine to induce hypertrophy. To this end, three specific objectives were addressed: 1) To identify differentially expressed lncRNAs and mRNAs in norepinephrine-induced neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy; 2) To determine the participation of differentially expressed lncRNAs in ceRNA networks in norepinephrine-induced neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy; and 3) To identify m6A modifications in differentially expressed lncRNAs that participate in ceRNAs in norepinephrine-induced neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy. To test this hypothesis, an in vitro hypertrophy model was established by stimulating neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVMs) with NE for 24 hours. The hypertrophic phenotype was validated through morphological analysis to assess cell area and perimeter, qPCR, and Western blot analysis of classic markers such as ANP (Nppa), BNP (Nppb), RCAN1 (Rcan1), and β-MHC (Myh7). Subsequently, total RNA sequencing (RNA-seq) and small RNA sequencing (sRNA-seq) were performed to identify differentially expressed (DE) mRNAs, lncRNAs, and miRNAs. This was complemented by functional enrichment analysis (Gene Ontology/KEGG) and lncRNA-mRNA expression correlation analysis. To explore post-transcriptional interactions, ceRNA networks were constructed based on in silico lncRNA-miRNA-mRNA predictions using the IntaRNA and miRWalk programs, along with connectivity topology analysis. Finally, direct RNA sequencing (DRS) was performed using Oxford Nanopore Technology (ONT), along with the m6Abasecaller/modPhred workflow, to identify and quantify m6A-type modifications in model-relevant transcripts. The results showed that NE induces global transcriptomic reprogramming characterized by the activation of anabolic and structural genes (such as Bcat1, Acnt1) and changes at the level of cellular metabolism and autophagy (such as Ulk1, Gpr22), revealing two opposing functional modules. In this context, DE hub lncRNAs were identified, such as ENSRNOT00000165859 (an isoform of ENSRNOG00000086264) in the activated axis and ENSRNOT00000127110 (an isoform of ENSRNOG00000087293) in the repressed axis. The constructed ceRNA networks suggest that upregulated lncRNAs act by sequestering anti-hypertrophic miRNAs (miR-150-5p, miR-708-5p), allowing the derepression of growth genes such as Bcat1; while the repression of protective lncRNAs released pathological miRNAs (miR-132-3p, let-7c), resulting in the silencing of Ulk1. Complementarily, m6A analysis revealed a highly consistent bimodal epitranscriptomic signature: lncRNAs and mRNAs of the pro-hypertrophic axis exhibited hypermethylation (Hyper-m6A), suggesting a possible stabilization mechanism and ceRNA function; conversely, transcripts of the protective axis underwent loss of methylation (hypomethylation), consistent with their destabilization and degradation. Taken together, these findings allow us to propose an epitranscriptomic-ceRNA synergy model, in which NE-induced hypertrophy arises from the hierarchical convergence between differential expression and m6A modification, positioning lncRNAs as potential key integrating elements that sustain cell growth at the expense of proteostasis and autophagy. This study not only identifies new candidate lncRNAs with potential functional relevance but also establishes an integrative conceptual framework that opens opportunities to validate mechanisms and project therapeutic applications based on the modulation of the epitranscriptomic machinery.