Descifrando el papel de las variantes de U5 snRNA en la biología del cáncer de mama triple negativo

Abstract

El splicing es un proceso fundamental en la maduración del pre-mRNA, llevado a cabo por el spliceosoma, un complejo ribonucleoproteico integrado por cientos de proteínas conocidas como factores de splicing y cinco RNA nucleares pequeños (snRNA) denominados U1, U2, U4, U5 y U6. El spliceosoma puede producir múltiples isoformas de mRNA a partir de un mismo pre-mRNA mediante un proceso conocido como splicing alternativo. En humanos, la mayoría de los genes que son procesados por splicing también experimentan splicing alternativo. La desregulación del splicing alternativo se ha asociado con diversas patologías, especialmente en cáncer. En la literatura existe evidencia sólida que identifica la desregulación del splicing como un proceso clave en el desarrollo y mantenimiento de características distintivas del cáncer, como lo son la evasión de la apoptosis, la desregulación del ciclo celular y la transición epitelial-mesenquimal, entre otras. Sin embargo, a pesar de que la actividad del spliceosoma depende de la coordinación entre sus componentes proteicos y ribonucleicos, la mayor parte de estas investigaciones se ha centrado casi exclusivamente en estudiar los factores de splicing, dejando prácticamente inexplorado el papel que los snRNA podrían desempeñar en esta patología. Investigaciones recientes han identificado que los snRNA pueden encontrarse mutados o presentar expresión alterada en cáncer. En particular, el snRNA U5 presenta una expresión heterogénea de cinco variantes principales (U5A, U5B, U5D, U5E y U5F) y se ha observado que las variantes U5D y U5F están sobreexpresadas en diversas líneas celulares de cáncer y en tumores, entre ellos en cáncer de mama triple negativo (TNBC), un subtipo de cáncer de mama caracterizado por su alta agresividad y resistencia a tratamientos convencionales. En esta investigación hipotetizamos que cada variante de U5 snRNA tiene un rol especializado y que modular la expresión de cada variante de U5 altera patrones específicos de splicing y fenotipos celulares en TNBC. Mediante CRISPR/Cas9, generamos líneas celulares con deleciones específicas de cada variante U5. El análisis por RNA-seq reveló el impacto de cada deleción en los patrones de splicing, mientras que ensayos celulares caracterizaron cambios en proliferación, viabilidad y ciclo celular. Estos datos apoyan funciones no redundantes de las variantes de U5 en TNBC, sugiriendo funciones especializadas que motivan análisis mecanísticos adicionales y abren una nueva perspectiva para abordar esta patología.

Splicing is a fundamental process in pre-mRNA maturation, carried out by the spliceosome, a ribonucleoprotein complex composed of hundreds of proteins known as splicing factors and five small nuclear RNAs (snRNAs) designated U1, U2, U4, U5, and U6. The spliceosome can produce multiple mRNA isoforms from a single pre-mRNA through a process known as alternative splicing. In humans, most genes that undergo splicing also experience alternative splicing. Dysregulation of alternative splicing has been associated with various pathologies, particularly cancer. Substantial evidence in the literature identifies splicing dysregulation as a key process in the development and maintenance of cancer hallmarks, including apoptosis evasion, cell cycle deregulation, and epithelial-mesenchymal transition, among others. However, despite the spliceosome's activity depending on the coordination between its protein and ribonucleic components, most research has focused almost exclusively on studying splicing factors, leaving the role that snRNAs might play in this pathology virtually unexplored. Recent studies have identified that snRNAs can be mutated or exhibit altered expression in cancer. Notably, U5 snRNA displays heterogeneous expression of five major variants (U5A, U5B, U5D, U5E, and U5F), and overexpression of variants U5D and U5F has been observed in various cancer cell lines and tumors, including triple-negative breast cancer (TNBC), a breast cancer subtype characterized by high aggressiveness and resistance to conventional treatments. In this research, we hypothesized that each U5 snRNA variant has a specialized role and that modulating the expression of each U5 variant alters specific splicing patterns and cellular phenotypes in TNBC. Using CRISPR/Cas9, we generated cell lines with specific deletions of each U5 variant. RNA-seq analysis revealed the impact of each deletion on splicing patterns, while cellular assays characterized changes in proliferation, viability, and cell cycle. These data support non-redundant functions of U5 variants in TNBC, suggesting specialized roles that warrant further mechanistic analysis and open new perspectives for addressing this pathology.