Efecto del acetato producido por Escherichia coli comensal sobre la virulencia de Escherichia coli productora de toxina Shiga en un modelo de infección de Galleria mellonella

Abstract

El tracto gastrointestinal humano alberga una microbiota diversa que desempeña funciones esenciales para la homeostasis intestinal. Durante los episodios de diarrea, se han descrito alteraciones tanto en la composición microbiana como en el perfil de metabolitos del lumen intestinal. Entre los agentes etiológicos responsables de la diarrea en población pediátrica, Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) constituye un patógeno de relevancia clínica, asociado a cuadros de diarrea sanguinolenta y a complicaciones graves como el síndrome hemolítico urémico. Diversos estudios han demostrado que la virulencia de STEC puede estar modulada por la microbiota intestinal y por metabolitos bacterianos que influyen en su colonización y expresión génica. Entre estos metabolitos, el acetato destaca como el ácido graso de cadena corta más abundante en el intestino, representando entre el 60 y el 65 % del total de estas moléculas. Se ha propuesto que el acetato participa en la regulación de genes asociados a la patogénesis de STEC. En este contexto, análisis metagenómicos realizados en nuestro laboratorio evidenciaron que muestras de diarrea positivas para STEC presentaban concentraciones significativamente mayores de acetato que las de niños sanos. Este aumento se correlacionó con una mayor abundancia relativa de E. coli no patogénica, lo que sugiere que este género podría contribuir a generar un entorno metabólico que favorezca la virulencia del patógeno. La presente tesis evaluó el efecto del acetato producido por cepas de E. coli aisladas de muestras de deposición positivas para STEC sobre la mortalidad inducida por este patógeno en el modelo in vivo de Galleria mellonella. Para ello, se aislaron cepas clínicas de E. coli no patogénica a partir de muestras de diarrea por STEC y se cuantificó su producción de acetato tras su crecimiento en condiciones anaeróbicas, mediante cromatografía líquida de alta eficiencia y un ensayo enzimático. Con el fin de determinar si el acetato era el principal factor del efecto observado, se utilizó una cepa mutante con deleción del gen pta, que codifica la fosfotransacetilasa, una enzima clave en la vía de producción de acetato. La deleción de pta redujo significativamente la producción de acetato, mientras que la complementación genética restauró parcialmente la acumulación de acetato. No obstante, en el modelo in vivo de G. mellonella, los sobrenadantes bacterianos aumentaron significativamente la mortalidad inducida por STEC, independientemente del estado funcional del gen pta. Asimismo, la administración de acetato exógeno no reprodujo el efecto observado con los sobrenadantes completos. En conjunto, estos resultados indican que el entorno metabólico generado por E. coli modula la mortalidad inducida por STEC en el modelo de Galleria mellonella, lo que sugiere que otros componentes solubles presentes en el sobrenadante, más allá del acetato, podrían ser responsables a este fenómeno.

The human gastrointestinal tract harbors a diverse microbiota that plays essential roles in intestinal homeostasis. During episodes of diarrhea, alterations have been described both in microbial composition and in the profile of metabolites present in the intestinal lumen. Among the etiological agents responsible for diarrhea in the pediatric population, Shiga toxin–producing Escherichia coli (STEC) represents a clinically relevant pathogen associated with bloody diarrhea and severe complications such as hemolytic uremic syndrome. Shiga toxin, encoded by the stx genes, induces damage to the intestinal epithelium and vascular endothelium. Several studies have demonstrated that STEC virulence can be modulated by the intestinal microbiota and by bacterial metabolites capable of influencing colonization and gene expression. Among these metabolites, acetate is the most abundant short-chain fatty acid in the intestine, accounting for approximately 60–65% of the total. Acetate has been proposed to participate in the regulation of genes associated with STEC pathogenesis, including stx and determinants involved in epithelial adhesion. In this context, metagenomic analyses conducted in our laboratory revealed that stool samples positive for STEC exhibited significantly higher acetate concentrations compared to control samples. This increase correlated with a higher relative abundance of non-pathogenic E. coli, suggesting that this genus may contribute to the generation of a metabolic environment that favors pathogen virulence. This thesis evaluated the effect of acetate produced by E. coli strains isolated from STEC-positive stool samples on STEC-induced mortality in the in vivo model of Galleria mellonella. Clinical non-pathogenic E. coli isolates were obtained, and acetate production was quantified following anaerobic growth using high-performance liquid chromatography and an enzymatic assay. To determine whether acetate was the primary determinant of the observed effect, a deletion mutant of the pta gene, encoding phosphotransacetylase—a key enzyme in the acetate production pathway—was generated. Since it was not possible to obtain a mutant in the clinical genetic background, an isogenic system derived from E. coli K-12 MG1655 was employed, including a wild-type strain, a Δpta mutant, and its corresponding complemented strain. Deletion of pta significantly reduced acetate production, while genetic complementation partially restored its accumulation. However, in the in vivo model of G. mellonella, bacterial supernatants significantly increased STEC-induced mortality independently of the functional status of pta. Furthermore, exogenous acetate administration did not reproduce the effect observed with complete bacterial supernatants.