Optimización de condiciones de cultivo para la expresión recombinante de una nitrilasa de la arquea hipertermófila Pyrococcus sp. M24D13 y caracterización de su especificidad para sustratos de interés farmacéutico

Abstract

Las nitrilasas son enzimas de interés biotecnológico por su capacidad de catalizar la hidrólisis directa de nitrilos a ácidos carboxílicos. Estas reacciones tienen el potencial de integrarse en procesos que generen productos de alto valor comercial en la industria farmacéutica. Sin embargo, las nitrilasas mesófilas están limitadas por sus condiciones operativas, mientras que las hipertermófilas han sido poco explotadas debido a problemas de expresión, solubilidad y funcionalidad. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial de la nitrilasa hipertermófila NitM24, proveniente de Pyrococcus sp. M24D13, como biocatalizador para la transformación de nitrilos de interés farmacéutico bajo condiciones operativas exigentes. Se desarrolló un nuevo protocolo de expresión independiente de IPTG, optimizado mediante un diseño experimental de superficie de respuesta, lo que permitió aumentar de manera significativa la producción total, soluble y funcional de NitM24 en E. coli. De forma complementaria, se emplearon herramientas bioinformáticas predictivas de manera exploratoria para apoyar la interpretación estructural y orientar la selección de sustratos. Los ensayos bioquímicos mostraron que NitM24 presenta preferencia por nitrilos aromáticos y arilacéticos, y que la incorporación de co-solventes orgánicos como 1,4-dioxano, DMF y DMSO permitió superar limitaciones de solubilidad y mejorar el rendimiento catalítico. Esta estrategia incrementó la actividad con 2-cianopiridina y fenilglicinonitrilo, y amplió el espacio de sustratos accesibles hacia compuestos voluminosos de interés farmacéutico, incluyendo 2-(3-benzoilfenil)-propionitrilo, un precursor de ketoprofeno, y 1-cianonaftaleno. Estos resultados posicionan a NitM24 como un biocatalizador robusto y versátil, con potencial para su integración en rutas sintéticas farmacéuticas específicas y en procesos complementarios de re-valorización química.

Nitrilases are biotechnologically relevant enzymes due to their ability to catalyse the direct hydrolysis of nitriles to carboxylic acids. These reactions have the potential to be integrated into processes that generate high-value products for the pharmaceutical industry. However, mesophilic nitrilases are constrained by their operational conditions, whereas hyperthermophilic nitrilases remain largely underexploited due to limitations related to recombinant expression, solubility, and functionality. The aim of this work was to evaluate the potential of the hyperthermophilic nitrilase NitM24, derived from Pyrococcus sp. M24D13, as a biocatalyst for the transformation of pharmaceutically relevant nitriles under demanding operational conditions. A novel IPTG-independent expression protocol was developed and optimised using a response surface experimental design, resulting in a significant increase in total, soluble, and functional NitM24 production in E. coli. In parallel, predictive bioinformatic tools were employed in an exploratory manner to support structural interpretation and guide substrate selection. Biochemical assays demonstrated that NitM24 preferentially transforms aromatic and arylacetic nitriles, and that the incorporation of organic co-solvents such as 1,4-dioxane, DMF, and DMSO effectively overcame solubility limitations and enhanced catalytic performance. This strategy improved activity towards 2-cyanopyridine and phenylglycinonitrile and expanded the accessible substrate space to bulky pharmaceutically relevant compounds, including 2-(3benzoylphenyl)propionitrile, a ketoprofen precursor, and 1-cyanonaphthalene. Collectively, these results position NitM24 as a robust and versatile biocatalyst with potential for integration into specific pharmaceutical synthetic routes and complementary chemical revalorisation processes.