Estableciendo la interacción de nuevos patrones moleculares asociados a daño inducibles (PiDAMPs) con receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) en células THP-1

Abstract

Este estudio explora la interacción entre Patrones Moleculares Asociados a Daño Inducibles Putativos (PiDAMPs) y Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs), específicamente de tipo Toll (TLRs), como parte del efecto inmunoestimulador del lisado tumoral alogénico TRIMEL, derivado de tres líneas celulares de melanoma humano (Mel1, Mel2, Mel3) sometidas a choque térmico controlado. Este tratamiento de las líneas tumorales promueve la expresión de proteínas de estrés térmico y la liberación de DAMPs, los cuales actúan como señales de activación inmunitaria en células dendríticas (DCs). Utilizando la línea monocítica humana THP-1 como modelo de DCs, se evaluó la presencia basal de diversos TLRs y se implementó un protocolo de estimulación celular con PiDAMPs seleccionados (Haptoglobina, HIST2H2AC, TDP-43, FLNC y HIST2HAA3), con el fin de estudiar sus patrones de localización subcelular y su posible co-localización con TLRs en la membrana plasmática o compartimientos intracelulares de las DCs. La inmunofluorescencia indirecta y la microscopía confocal permitieron cuantificar la intensidad y co-localización mediante coeficientes de Manders y densidad integrada normalizada. Los resultados mostraron interacciones específicas entre ciertos PiDAMPs y TLRs, destacando la fuerte co-localización entre HP y TLR-4, así como entre HIST2H2AC y TLR-4, ambas localizadas preferentemente en membrana. En contraste, no se observó co-localización significativa entre HP y TLR-2, lo que sugiere especificidad funcional. En el caso de TLRs intracelulares (TLR-3, TLR-8 y TLR-9), aunque hubo un aumento de señal tras estimulación con HP o TDP-43, no se evidenció incremento de co-localización, sugiriendo una interacción débil o no perceptible bajo las condiciones evaluadas. Este trabajo entrega evidencia experimental que respalda el rol de candidatos a DAMPs no caracterizados como potenciales coadyuvantes inmunológicos, abre nuevas hipótesis sobre la especificidad de las interacciones DAMP/PRR, y propone un enfoque metodológico aplicable a la caracterización funcional de ligandos inmunoestimuladores emergentes.

This study investigates the interaction between putative inducible Damage-Associated Molecular Patterns (PiDAMPs) and Pattern Recognition Receptors (PRRs), particularly Toll-like Receptors (TLRs), as part of the immunostimulatory effect of the allogenic tumor lysate TRIMEL, derived from three human allogenic melanoma cell lines (Mel1, Mel2, and Mel3) subjected to controlled heat shock. This treatment induces the expression of stress proteins and the release of DAMPs in tumor cell lines, which act as danger signals for the activation of dendritic cells (DCs). Using the human monocytic THP-1 cell line as a DC model, basal expression of various TLRs was assessed, and a stimulation protocol with selected PiDAMPs (Haptoglobin, HIST2H2AC, TDP-43, FLN-C, and HIST2HAA3) was applied to study their subcellular distribution and potential co-localization with TLRs in plasma membrane or intracellular compartments. Indirect immunofluorescence and confocal microscopy were used to quantify signal intensity and spatial co-localization using Manders’ coefficients and normalized integrated density per cell. The results revealed specific interactions between certain PiDAMPs and TLRs, notably strong co-localization between Haptoglobin and TLR-4, as well as HIST2H2AC and TLR-4, both of which are predominantly localized to the membrane. In contrast, no significant co-localization was observed between Haptoglobin and TLR-2, suggesting functional specificity. For intracellular TLRs (TLR-3, TLR- 8, and TLR-9), although signal intensity increased upon stimulation with HP or TDP-43, no corresponding increase in co-localization was detected, indicating a weak or imperceptible interaction under the tested conditions. This study provides experimental evidence supporting the role of PiDAMPs as potential immunological proteins, introduces new hypotheses regarding DAMP/PRR specificity, and offers a methodological framework applicable to the functional characterization of emerging immunostimulatory ligands.