| Abstract | dc.description.abstract | El uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial
biotecnológico, debido principalmente a que permiten la reducción de costos energéticos
en los procesos biotecnológicos. Las proteasas son enzimas proteolíticas de gran utilidad
en la industria biotecnológica. Sus aplicaciones industriales involucran principalmente a la
industria alimenticia, de detergentes y de cuero.
En este trabajo se aisló bacterias de origen marino antártico que producen enzimas
proteolíticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. El DNA genómico de las
mejores cepas se utilizó para realizar búsquedas de genes que codificaran para proteasas
tipo subtilisinas, utilizando partidores híbridos consenso-degenerados de oligonucleótidos
(CODEHOP). Esto permitió clonar y secuenciar fragmentos de DNA que codificaban para
regiones internas de tres proteasas tipo subtilisinas diferentes. A partir de estos fragmentos
se determinó la secuencia de los extremos 3’ y 5’ de los genes, mediante una técnica de
“genome walking” desarrollada para este trabajo. Se encontraron tres marcos de lectura
abiertos (ORF) de 2.253 pb (P4), 2.124 pb (P6) y 1608 pb (P7), que codificaban para
proteasas tipo subtilisina. Estos genes se expresaron con el sistema pET22b(+)/E. coli
BL21(D3E), mediante inducción con IPTG. Las proteasas se produjeron fusionadas a una
cola de histidina en el extremo C-terminal, permitiendo su purificación por cromatografía
de afinidad a níquel. La proteasa P6 presentó mayor actividad catalítica que la subtilisina
comercial Carlsberg a bajas temperaturas (5-25°C).
Por otro lado, el sobrenandante del cultivo de la cepa antártica p13/1-4,
correspondiente a la mejor productora de proteasa, se utilizó para purificar la enzima
proteolítica mediante cromatografía. La proteasa se llamó T8, y se clonó un fragmento del
gen de esta proteasa, mediante una estrategia que incluía un análisis de espectrometría
de masa y diseño de partidores degenerados. La secuencia completa del gen se
obtuvo mediante la técnica mejorada de “genome walking”, desarrollada en este
trabajo. Actualmente, esta proteína tipo-subtilisina se encuentra en etapa de expresión
recombinante.
Adicionalmente a este trabajo, se aisló el gen de una xilanasa adaptada a bajas
temperaturas utilizando partidores CODEHOP y la técnica de genome walking. Este gen
se expresó en el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(DE3), produciendo la xilanasa L activa
en el sobrenandante. Esta xilanasa recombinante se utilizó para desarrollar métodos de
evolución dirigida tales como PCR propenso a error (error-prone PCR) y recombinación al
azar (DNA shuffling). Esto permitió la obtención de una nueva variante de xilanasa con una
constante catalítica (kcat) tres veces mayor que la xilanasa L original.
Durante este trabajo de tesis se desarrolló diferentes estrategias que permitieron la
clonación, producción recombinante y evolución dirigida de diferentes enzimas hidrolíticas
adaptadas a bajas temperaturas. | |
