Aislamiento, Producción Recombinante y Evolución Dirigida de Nuevas Enzimas Hidrolíticas Bacterianas Adaptadas a Bajas Temperaturas

Abstract

El uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial biotecnológico, debido principalmente a que permiten la reducción de costos energéticos en los procesos biotecnológicos. Las proteasas son enzimas proteolíticas de gran utilidad en la industria biotecnológica. Sus aplicaciones industriales involucran principalmente a la industria alimenticia, de detergentes y de cuero. En este trabajo se aisló bacterias de origen marino antártico que producen enzimas proteolíticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. El DNA genómico de las mejores cepas se utilizó para realizar búsquedas de genes que codificaran para proteasas tipo subtilisinas, utilizando partidores híbridos consenso-degenerados de oligonucleótidos (CODEHOP). Esto permitió clonar y secuenciar fragmentos de DNA que codificaban para regiones internas de tres proteasas tipo subtilisinas diferentes. A partir de estos fragmentos se determinó la secuencia de los extremos 3’ y 5’ de los genes, mediante una técnica de “genome walking” desarrollada para este trabajo. Se encontraron tres marcos de lectura abiertos (ORF) de 2.253 pb (P4), 2.124 pb (P6) y 1608 pb (P7), que codificaban para proteasas tipo subtilisina. Estos genes se expresaron con el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(D3E), mediante inducción con IPTG. Las proteasas se produjeron fusionadas a una cola de histidina en el extremo C-terminal, permitiendo su purificación por cromatografía de afinidad a níquel. La proteasa P6 presentó mayor actividad catalítica que la subtilisina comercial Carlsberg a bajas temperaturas (5-25°C). Por otro lado, el sobrenandante del cultivo de la cepa antártica p13/1-4, correspondiente a la mejor productora de proteasa, se utilizó para purificar la enzima proteolítica mediante cromatografía. La proteasa se llamó T8, y se clonó un fragmento del gen de esta proteasa, mediante una estrategia que incluía un análisis de espectrometría de masa y diseño de partidores degenerados. La secuencia completa del gen se obtuvo mediante la técnica mejorada de “genome walking”, desarrollada en este trabajo. Actualmente, esta proteína tipo-subtilisina se encuentra en etapa de expresión recombinante. Adicionalmente a este trabajo, se aisló el gen de una xilanasa adaptada a bajas temperaturas utilizando partidores CODEHOP y la técnica de genome walking. Este gen se expresó en el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(DE3), produciendo la xilanasa L activa en el sobrenandante. Esta xilanasa recombinante se utilizó para desarrollar métodos de evolución dirigida tales como PCR propenso a error (error-prone PCR) y recombinación al azar (DNA shuffling). Esto permitió la obtención de una nueva variante de xilanasa con una constante catalítica (kcat) tres veces mayor que la xilanasa L original. Durante este trabajo de tesis se desarrolló diferentes estrategias que permitieron la clonación, producción recombinante y evolución dirigida de diferentes enzimas hidrolíticas adaptadas a bajas temperaturas.