Adaptacion Psicrofilica de la Endoglucanasa Mesofilica CEL5A de Bacillus Agaradhaerens

Abstract

Las enzimas psicrofílicas se caracterizan por presentar una gran actividad catalítica a bajas temperaturas (0 - 30 °C). A pesar que diversos factores y variables han sido asociados a la adaptación psicrofílica enzimática, generalmente se expone que las enzimas adaptadas a bajas temperaturas presentan esta propiedad debido a un incremento de su flexibilidad estructural, el cual permite la movilidad molecular necesaria para la ocurrencia del proceso de catálisis enzimática a bajas temperaturas. Durante los últimos años, el potencial uso de enzimas psicrofílicas en diversos procesos industriales y biotecnológicos ha generado gran interés debido principalmente a los considerables ahorros de energía y recursos que éste conlleva. El objetivo general de este trabajo de tesis es adaptar psicrofílicamente la endoglucanasa mesofílica Cel5A de Bacillus agaradhaerens, mejorando sus propiedades catalíticas a bajas temperaturas mediante la realización de mutaciones sitio dirigidas (I99A, A134Y/I99A y A134Y/I99A/N138L), las cuales se encuentran principalmente asociadas a un posible incremento de la flexibilidad estructural en la vecindad del sitio activo de esta enzima. Se intentó generar 3 variantes de la proteína Cel5A que contienen respectivamente las mutaciones I99A, A134Y/I99A y A134Y/I99A/N138L en el dominio catalítico de Cel5A clonado en el vector de expresión pET22b(+). Posteriormente, las endoglucanasas recombinantes se expresaron y purificaron para finalmente establecer los parámetros cinéticos (kcat y KM) y termodinámicos de activación (EA, ΔG#, ΔH# y ΔS#) de las reacciones catalizadas por estas enzimas a partir de los resultados obtenidos en los ensayos de actividad enzimática. La mutación I99A permite mejorar en aproximadamente un 70 % promedio la constante catalítica de la enzima en el rango de temperatura comprendido entre 5 °C y 30 °C, sin aumentar significativamente el proceso de inactivación enzimática en todo el rango de temperatura estudiado. Por otra parte, las mutaciones A134Y/I99A permiten mejorar en aproximadamente un 120 % promedio la constante catalítica de la enzima en el rango de temperatura comprendido entre 5 °C y 30 °C, incrementando notoriamente el proceso de inactivación enzimática a partir de temperaturas superiores a los 40 °C. Finalmente, no se logró estudiar el efecto de las mutaciones A134Y/I99A/N138L sobre las propiedades catalíticas de la endoglucanasa Cel5A debido a un error en la generación de esta variante, el cual estuvo probablemente asociado a interacciones inespecíficas que ocurrieron entre el ADN molde y uno de los partidores mutagénicos en la reacción de PCR. La variación de los parámetros cinéticos (kcat y KM) y termodinámicos de activación (EA, ΔH# y ΔS#) de las reacciones catalizadas por las endoglucanasas recombinantes permite inferir un aumento de la flexibilidad estructural en la vecindad del residuo catalítico ácido/base de todas las enzimas mutadas generadas en este trabajo de tesis, lo cual probablemente justifica la superioridad de la constante catalítica de las enzimas I99A y A134Y/I99A a bajas temperaturas (entre 5 °C y 30 °C), en comparación con la constante catalítica de la endoglucanasa nativa. Se cumple el objetivo general del trabajo de tesis pues las dos enzimas mutadas generadas (I99A y A134Y/I99A) mejoran claramente las propiedades catalíticas de la enzima nativa a bajas temperaturas.