Caracterización y Purificación de Dos Bioindicadores del Estado Funcional de Selenio

Abstract

El selenio es un nutriente esencial para los seres vivos. Recientemente se ha demostrado que la selenometilselenocisteína, forma orgánica de selenio, presenta efectos quimiopreventivos en cáncer de colon, pulmón, próstata y mama. Dado esto, se hace necesaria la identificación de biomarcadores capaces de indicar el estado funcional de selenio.

Mediante el uso de una aproximación proteómica en un modelo animal, se han determinado dos posibles bioindicadores. Ellos son las proteínas Transtiretina (TTR) y Apolipoproteína E (ApoE). Ambos presentaron un aumento en su expresión proporcional a la ingesta de selenometilselenocisteína. El presente trabajo de título pretende determinar las propiedades fisicoquímicas, peso molecular (PM), punto isoeléctrico (pI) e hidrofobicidad superficial promedio (HSP) de estos bioindicadores y estudiar un método de purificación preeliminar para la Transtiretina.

Para la determinación del PM y pI, se desarrollaron técnicas de SDS-PAGE e IEF en el equipo PhastSystem, escogido por su elevada sensibilidad de detección. Dado que esto fue infructuoso, se obtuvieron las propiedades desde geles bidimensionales realizados por la Profesora Andrea Mahn. Así, se estimó que el PM para TTR es de 13 KDa y el de ApoE 20 KDa, mientras que el pI de TTR se encuentra entre 5,6 a 6,0 y el pI de ApoE entre 5,0 y 5,6.

Para estimar la hidrofobicidad superficial promedio, obtenida como la contribución de todos los aminoácidos expuestos en la superficie de la proteína, se utilizaron las estructuras disponibles en bases de datos para TTR y se construyeron modelos para ApoE. Como resultado del modelamiento por homología utilizando el programa MODELLER se obtuvieron dos modelos ligeramente diferentes para la estructura tridimensional de ApoE. Ambos presentan más del 90% de los aminoácidos en las zonas permitidas del gráfico de Ramachandran, además otros parámetros evaluados también resultaron ser positivos. Así, se concluye que los modelos presentan buenas probabilidades de asemejarse a la estructura real de la proteína. Finalmente, se obtuvo que la hidrofobicidad superficial promedio para TTR es de 0,24 ± 0,01 y de 0,33 ± 0,02.

Como proceso de purificación de TTR, se postularon dos etapas. La primera corresponde a un sistema de dos fases acuosas (ATPS) formados por PEG-1000 y Fosfato, cuyo largo de línea de equilibrio fuera de 45, y la segunda etapa corresponde a la aplicación de una muestra tomada de la fase inferior del ATPS a una resina de afinidad usando como ligado tiroxina. Como resultado, se obtuvo un ATPS capaz de remover proteínas de elevado peso molecular y parcialmente albúmina (migran preferentemente hacia la fase superior) desde muestras de suero de rata, de manera reproducible. Se postula que TTR migra preferentemente hacia la fase inferior, sin embargo sería necesario realizar a futuro ensayos Western Blot o espectrometría de masa para comprobarlo. Con respecto a la cromatografía de afinidad realizada, tampoco es posible asegurar concluyentemente que TTR queda adsorbida o no en la matriz, sin embargo los resultados presentan algunos indicios positivos, cuyo análisis en profundidad permitiría determinar si los resultados obtenidos fueron positivos o no.