La cisteina desulfurasa (IscS) de Geobacillus stearothermophilus V confiere a Escherichia Cole resistencia a la telurito de potasio

Abstract

Los mecanismos que subyacen la resistencia bacteriana a telurito de potasio (K2TeO3 ) no son bien conocidos. La evidencia actual apoya la idea que varias vías metabólicas, a través de sus enzimas y/o sus productos, podrían estar participando en el fenómeno. Interesados en este fenómeno, nuestro grupo ha utilizado como modelo experimental la bacteria termofílica Gram positiva Geobacillus stearothermophilus V, la cual exhibe resistencia natural a K2TeO3 . Utilizando genotecas de este microorganismo construidas con la enzima HindIII se transformó células de E. coli sensibles a K2TeO3 seleccionándose por la adquisición de un fenotipo de resistencia (TelR). Uno de los clones TelR obtenidos porta el plasmidio recombinante p2VH, que contiene un inserto de 3.461 pb de DNA cromosomal de G. stearothermophilus V clonado en el vector pSP72. En el inserto se identificaron tres marcos de lectura abiertos (ORFs) de más de 200 residuos de aminoácidos. El ORF1 (687pb) especifica una metalopeptidasa, el ORF2 (1200 pb) codifica para una cisteína desulfurasa y el ORF3 (963 pb) contiene información para una aminopeptidasa. Experimentos de subclonamiento demostraron que el ORF2 es el único responsable de conferir resistencia a K2TeO3 en E. coli. El producto de este gen (iscS) es una cisteína desulfurasa (IscS) que fue sobreexpresada, purificada a homogeneidad y parcialmente caracterizada. Se trata de una proteína con una Mr de 45 kDa por subunidad y que en estado nativo constituye un homodiméro de aproximadamente 95 kDa que posee unido el cofactor piridoxal fosfato (PLP). Experimentos de mutagénesis (por deleción en su extremo 3’ y por sustituciones definidas en el codón 213) del gen iscS permitieron determinar que la resistencia a K2TeO3 es dependiente de la actividad cisteína desulfurasa. Otra evidencia que indicó una relación entre la expresión del gen iscS de G. stearothermophilus V y resistencia a K2TeO3 provino de ensayos de complementación de cepas E. coli deficientes en el gen iscS endógeno que presentaban un fenotipo de hipersensibilidad a K2TeO3 . La introducción del gen iscS del bacilo termofílico en E. coli PK6311resultó en la adquisición de resistencia a la sal tóxica y en la recuperación parcial del fenotipo de crecimiento lento exhibido por esta cepa. Adicionalmente, la expresión de este gen suprimió el requerimiento de tiamina pero no el de ácido nicotínico de E. coli PK6311 para poder desarrollarse en medio mínimo. Por otro lado, la cepa de E. coli QC774 (sodA sodB) también adquirió resistencia a K2TeO3 cuando fue transformada con iscS de G. stearothermophilus V, sugiriendo que la toxicidad del telurito podr{ia estar relacionada a un daño oxidativo.

The mechanisms underlying bacterial resistance to potassium tellurite (K2TeO3 ) are not well understood. Recent evidence support the idea that enzymes and/or their substrates from certain metabolic routes could participate in this resistance. Interested in studying this phenomenon, our group has employed the tellurite-resistant, thermophilic, Gram positive rod Geobacillus stearothermophilus V as substrate. Tellurite-sensitive E. coli cells were transformed with different gene libraries of G. stearothermophilus V and TelR transformants were isolated. One of them carries the recombinant plasmid p2VH, which contains a 3,461 bp HindIII fragment of G. stearothermophilus V chromosomal DNA cloned into vector pSP72. Three open reading frames (ORFs) larger than 200 amino acid residues were identified in the insert. ORF1 (687 bp) specifies a metallopeptidase, ORF2 (1200 bp) codes for a cysteine desulfurase and ORF3 (963 bp) carries information for an aminopeptidase. Subcloning experiments demonstrated that only ORF2 was responsible for confering K2TeO3 resistance in E. coli. The product of the iscS gene is a cysteine desulfurase (IscS) which was overexpressed, purified to near homogeneity and partially characterized. The protein subunit exhibits a Mr of 45 kDa and in its native conformation the enzyme is a homodimer of about 95 kDa which has bound pyridoxal phosphate (PLP). Mutagenesis of the iscS gene (by deletion of defined portions of its 3’end and by making defined substitutions in codon 213) allowed us to determine that resistance to K2TeO3 is dependent on the cysteine desulfurase activity. Another line of evidence that allowed to establish a relationship between the expression of the G. stearothermophilus V iscS gene and K2TeO3 resistance came from complementation assays of iscS-deficient, tellurite-hypersensitive E. coli strains. The expression of the iscS gene from the thermophilic rod in E. coli PK6311resulted in the acquisition of tellurite resistance and in the partial recovery of the slow growth phenotype exhibited by these cells. Also, iscS gene expression supressed the requirement for thiamine (but not for nicotinic acid) of this strain to grow in minimal media. On the other hand, E. coli QC774 (sodA sodB) strain also acquired resístanse to tellurite when transformed with the G. stearothermophilus V iscS gene, suggesting that tellurite toxicity could be related to oxidative damage.