Estudio del efecto de la adición de extremos polipeptídicos hidrofóbicos en la expresión y purificación de proteínas recombinantes

Abstract

El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.