Evaluación de proacrosina/acrosina mediante western-blot en espermatozoides congelados de perro durante la capacitación in vitro

Abstract

Dentro de las biotecnologías reproductivas, la criopreservación de espermatozoides presenta grandes ventajas, sin embargo, involucra cambios en el espermatozoide, tanto estructurales como funcionales, que alterarían eventos fisiológicos asociados a la fecundación, como la capacitación y reacción acrosómica. Esto puede significar cambios en la activación y liberación del sistema proacrosina/acrosina, involucrada en los primeros eventos de interacción ovocito-espermatozoide, por tanto, el objetivo de este trabajo, fue evaluar el sistema proacrosina/acrosina mediante western blot en espermatozoides congelados de perro, en comparación con aquellos frescos, durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se recolectaron 6 eyaculados, de tres perros sanos, a través de estimulación digital. Se utilizó la fracción espermática de cada eyaculado tanto para los controles (frescos) y los congelados. Las muestras procesadas como frescas fueron resuspendidas luego de una centrifugación en medio Fert-Talp y los espermatozoides que se sometieron a congelación se resuspendieron en diluyente en base a fructosa, TRIS, 20% de yema de huevo, ácido cítrico y 5% de glicerol y fueron posteriormente congelados a -196ºC en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 60º C durante 8 segundos en agua. Las muestras se centrifugaron y el pellet de espermatozoides se diluyó en medio Fert-Talp dejándose en incubación en el mismo medio para capacitación durante 0, 30, 60 y 90 minutos. Posteriormente las muestras fueron sometidas a extracción de proteínas espermáticas a las cuales se les adicionó buffer de carga 4X para ser separadas mediante electroforesis y luego detectadas a través de western blot utilizando el anticuerpo C5F10 (anticuerpo de ratón antiacrosina humana). Una vez obtenidas las bandas de proacrosina y acrosina ( y β) se evaluó la densidad óptica de cada una de ellas con el programa PhotoShop 8.0. Los resultados obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y prueba de Tukey. Los resultados mostraron la presencia del zimógeno proacrosina y las subunidades de la enzima activa ( y β acrosina) en los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos y congelados. En cada uno de los tiempos de capacitación se encontró mayor densidad óptica de proacrosina (P<0,05) en las muestras frescas lo cual indica una mayor cantidad del zimógeno. En la enzima activa -acrosina de las muestras congeladas, hubo diferencias (P<0,05), siendo mayor la densidad óptica a los 30 minutos de capacitación en comparación con los otros tiempos de capacitación. Se encontró mayor reactividad de -acrosina en las muestras congeladas a los 0 y 30 minutos en comparación con las muestras frescas. En β-acrosina se encontró en las muestras congeladas una mayor densidad óptica a los 0 minutos la que disminuyó hasta los 90 minutos de capacitación. Al analizar β -acrosina en cada uno de los tiempos de capacitación entre congelados y frescos se encontraron diferencias significativas (P< 0.05) a los 0, 30, 60 y 90 minutos de capacitación siendo mayor en las muestras congeladas. En conclusión los espermatozoides congelados presentan mayor activación del zimógeno al comparar con los frescos, la cual va disminuyendo en la medida que el tiempo de capacitación es mayor