Producción de bioetanol a partir de ácidos grasos en cultivos aeróbicos de escherichia coli K12, utilizando ingeniería genética y herramientas de ingeniería metabólica

Abstract

Los ácidos grasos son un subproducto de bajo costo, abundante y cuyo producto de degradación puede ser fácilmente convertido en etanol, sin embargo no han sido debidamente considerados en la búsqueda de substitutos para combustibles fósiles. El principal inconveniente de la producción de bioetanol a partir de ácidos grasos en Escherichia coli, es que la síntesis de este metabolito es inactivada en presencia de oxígeno y la degradación de este polímero es más eficiente en presencia de este. Por ello, el primer paso fue realizar una modificación en el gen adhE que permitiera la codificación de un alcohol deshidrogenasa aerotolerante. A continuación y para optimizar la producción de etanol fue necesario considerar factores como el equilibrio redox y la alta conectividad del acetil-CoA, mediante herramientas de modelamiento matemático como el análisis de modos elementales. Como resultado es estos análisis se logró la predicción de la deleción de los genes fdnG (f), pflB (p), nuoG(n), ldhA(l) y ackA-pta (ap), y mediante técnicas basadas en PCR se generaron 3 cepas en E. coli K12 MG1655: fnfp*, fnfpl*y fnfplap*. Al realizar cultivos batch de estas cepas fue posible validar la tendencia predicha por la simulación in silico de un aumento significativo y sostenido en el flujo de etanol a medida que aumenta el número de deleciones, siendo clave la deleción del gen nuoG. Con respecto al crecimiento de las cepas en ácidos grasos, la cepa fnfplap* presentó una tasa de crecimiento y una producción de biomasa significativamente superior a la cepa silvestre de E. coli y a la mutante ΔfadR atoC*, e incluso fue capaz de crecer en desechos industriales del refinamiento de aceites vegetales. En estos cultivos, la tasa de producción de etanol también fue significativamente mayor al valor en ácido palmítico purificado, lo que muestra tanto el potencial de la cepa para ser utilizada a nivel industrial como el efecto del medio de cultivo en la producción de etanol. A pesar de estos resultados, los valores experimentales de producción de etanol no coincidieron con los obtenidos en la simulación, por lo que se realizaron simulaciones con un modelo genómico de E. coli. Estos análisis permitieron, por una parte, obtener información sobre posibles genes para eliminar, de modo de permitir la optimización de la producción de etanol a partir de ácido palmítico en condiciones de cultivo aeróbico, pero sin afectar complejos enzimáticos tan importantes como el de la NADH deshidrogenasa; y por otra, corroborar la hipótesis de que la presencia de oxígeno es indispensable para la degradación de los ácidos grasos. Los resultados de este trabajo de tesis muestran que fue posible producir etanol en un sistema de cultivo aeróbico usando como sustrato ácidos grasos, incluso en aquellos provenientes de desechos industriales, obteniéndose una cepa especializada en consumo de ácidos grasos. Adicionalmente, se mostró que el contenido del medio y la estrategia de cultivo pueden afectar directamente tanto la producción de etanol como de biomasa, hasta el punto de obtenerse niveles atractivos para la industria y el tratamiento de desechos ricos en este polímero.