Morphology of the Eyeball, Orbit and Retina of Atlantic Salmon (Salmo Salar) Alevins under Hypoxic Conditions

Abstract

It has been demonstrated that hypoxia retards the growth of fish, reduces the survival of their larvae, deforms their vertebral column, but despite this teleost fish have the ability to completely regenerate many of their tissues, particularly the retina. As we do not have enough information about the effects of hypoxia on the eyeball, orbit and retina of Atlantic salmon (Salmo salar), we propose the following objectives: 1) Compare the morphological changes of the eyeball of fish subject to hypoxia and normoxia. 2) Determine changes in the orbit structure. 3) Describe the retina of salmon alevins. 4). Recognize hypoxic cells using the anti-Hif1 alpha antibody in the retina of alevins as a sensor. 5) Determine the Shh morphogenic expression in alevins exposed to different times of hypoxia. Around 1,000 Salmo salar alevins were placed in a continuous water flow of 9 degrees C at 100 % SatO(2) and alevins maintained at a hypoxia of 60 % SatO(2). The latter were transferred to normoxia (at days two, four, and eight after hatching). A control group maintained at continuous normoxia and another at continuous hypoxia was also considered. All the alevins were euthanized at 950 UTAs (+/- 2 months after hatching). Diaphonization (double-stain) according to the Hanken & Wassersug technique was undertaken to describe the morphology of the periocular cartilage and to measure the ocular diameter. The HIF-1 alpha factor antibody 1: 50, and the anti-Shh antibody dilution of 1:100 were used. The alevins after hatching had large eyeballs with the optic cup having an embryonic shape, even a choroidal fissure. The greatest thickness was observed in the nasal ventral zone which corresponds to a zone of pluripotent cells. The optic cup aspect with embryonic characteristics has only been reported in salmonids. The central retina of the alevins those were cultivated with a 60 % saturation of O-2 for two, four or eight days had positive immunostaining when analyzed with the anti-HIF1 alpha antibody hypoxia sensor. The inner ganglion and nuclear layers had immunopositive cells, with the highest in the alevins that were two days in hypoxia and the lowest when the hypoxia was chronic. Nevertheless, in the latter case the alevins had anatomical deformation of the eyeball and periocular cartilage. The anti-Shh antibody clearly shows a gradient that is expressed in the germinative zone and in the cells of the inner ganglion and nuclear layers. The eyeball and particularly the retina in salmon alevins are an example of neuronal plasticity and neurogenesis.

Se ha demostrado que la hipoxia retarda el crecimiento de los peces, reduce la supervivencia de sus larvas, deforma su columna vertebral, pero a pesar de esto, este pez teleósteo tiene la capacidad de regenerar completamente muchos de sus tejidos, en particular la retina. Como no existe suficiente información sobre los efectos de la hipoxia en el bulbo ocular, la órbita y retina del salmón del Atlántico (Salmo salar), los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar los cambios morfológicos del bulbo ocular del pescado sujetos a hipoxia y normoxia; 2) Determinar los cambios en la estructura de la órbita; 3) Describir la retina de los alevines de salmón; 4) Reconocer las células hipóxicas utilizando el anticuerpo anti-Hif1a en la retina de alevines como un sensor; 5) Determinar la expresión morfogenética de Shh en alevines expuestos a diferentes momentos de hipoxia. Alrededor de 1.000 alevines Salmo salar se colocaron en un flujo continuo de agua a 9 °C, con 100 % de SatO2 y otros alevines se mantuvieron con una hipoxia de 60 % SatO2. Estos últimos fueron trasladados a normoxia (en los días dos, cuatro y ocho después de la eclosión). Un grupo control se mantuvo a normoxia continua y otro grupo a hipoxia continua. Todos los alevines se sacrificaron a 950 UTA (+ dos meses después de la eclosión). Se realizcón una diafonización (doble tinción), de acuerdo con la técnica de Hanken & Wassersug, para describir la morfología del cartílago periocular y para medir el diámetro ocular. Se utilizaron el anticuerpo anti-Hif1a a una dilución 1:50, y el anticuerpo anti-Shh a una dilución de 1:100. Los alevines después de la eclosión presentaron grandes bulbos oculares, con la copa óptica con forma embrionaria, incluso una fisura coroidea. El mayor espesor se observó en la zona ventral nasal que corresponde a una zona de células pluripotentes. El aspecto de la copa óptica con características embrionarias sólo se ha informado en los salmónidos. La retina central de los alevines fueron cultivadas con una saturación de 60 % de O2 para dos, cuatro y ocho días, y presentó inmunotinción positiva cuando se analizó con el sensor de hipoxia, el anticuerpo anti-HIF1a. El ganglio interior y las capas nucleares presentaron células immunopositivas, con los niveles más altos en los alevines con dos días de hipoxia y niveles más bajos en hipoxia crónica. Sin embargo, en éste último caso los alevines presentaron una deformación anatómica del bulbo ocular y el cartílago periocular. El anticuerpo anti-Shh mostró claramente un gradiente expresado en la zona germinativa y en las células del ganglio interior y las capas nucleares. El bulbo ocular y en particular la retina en alevines de salmón son un ejemplo de plasticidad neuronal y neurogénesis.