Design of an extraction process of phlorotannins and carbohydrate Macrocystis pyrifera, integrating the use of marine enzymes in the step of carbohydrate hydrolisis

Abstract

La macroalga parda Macrocystis pyrifera es una especie de algas marinas que posee una amplia distribución en aguas templadas y frías tanto del hemisferio norte como sur, formando bosques productivos de alta diversidad biológica. En Chile M. pyrifera se distribuye a lo largo de la costa desde Iquique al Cabo de Hornos. La importancia comercial de esta especie se ha incrementado en la última década, especialmente en la extracción de alginato y su uso como alimento de abalones. El alga se compone principalmente de carbohidratos heterogéneos (> 50% peso seco del alga) como fucoidano, alginato y laminarina, los cuales pueden ser empleados como plataforma para la producción de variados compuestos. Además, posee compuestos polifenólicos únicos en su especie conocidos como florotaninos los cuales han sido ampliamente estudiados por sus beneficios potenciales para la salud como anti-oxidantes, anti-cáncer, anti-diabetes, anti-inflamación y anti-microbianas, entre otras. En este trabajo se estudió el diseño de un proceso de extracción de florotaninos y carbohidratos desde M. pyrifera, usando enzimas marinas en la etapa de hidrolisis de los carbohidratos. Para lo cual se procedió en un primer paso a determinar condiciones que mejoran la extracción de florotaninos desde el alga, tales como temperatura de secado del alga, parámetros de extracción e identificación de los compuestos. En una segunda etapa se optimizó la producción de enzimas carbohidrasas, alginato liasa, fucoidanasa y 1,3-β-D-glucanasa, desde microorganismos marinos asociado a la macroalga, para ser empleadas posteriormente en el pre-tratamiento enzimático de M. pyrifera. En una tercera etapa se determinó condiciones de extracción simultánea de carbohidratos y florotaninos desde el alga incorporando la etapa previa de pre-tratamiento enzimático. Finalmente, se estudió la separación de florotaninos desde el extracto final usando resinas macroporosas. La evaluación de estas etapas permitió determinar que un pre-tratamiento enzimático del alga con carbohidrasas, producidas por el hongo marino Alternaria sp, a 25°C por 36 horas a un pH 7.0 y una razón alga/extracto enzimático de 1/20, seguido por extracción alcalina de fase solida con NaOH 0.5N a 100°C por 180 min en una razón sólido/líquido de 1/20. Obteniendo un extracto con concentración final de 452 mg carbohidrato/g alga y 2.14 mg florotaninos/g alga, lo cual representa un rendimiento de extracción específico de 89.6% para carbohidratos y 21.4% para florotaninos. Posteriormente, el uso de resina XAD-16N permitió la separación del 42% de los florotaninos desde el extracto. La fracción enriquecida en florotaninos fue liofilizada presentando una concentración de 14.2 mg florotaninos/g liofilizado.

The brown macroalgae Macrocystis pyrifera is a kind of seaweed that has a wide distribution in temperate and cold waters of both the Northern and Southern hemispheres, forming productive forests of high biological diversity. In Chile M. pyrifera it is distributed along the coast from Iquique to Cape Horn. The commercial importance of this species has increased in the last decade, especially in alginate extraction and use as food abalones. M. pyrifera (>50 % of the alga dry weight) as fucoidan, laminarin and alginate, which can be used as a platform for the production of many compounds is mainly composed of heterogeneous carbohydrate. In addition, the brown seaweeds have unique polyphenolic compounds in their species known as phlorotannins which have been widely studied for their potential health benefits such as prevention of oxidative stress-mediated radical, anti-cancer, anti-diabetes, anti-inflammation and anti-microbial, among others. In this work was studied in this paper the design of an extraction process phlorotannins and carbohydrates from Macrocystis pyrifera, using marine enzymes in the hydrolysis step carbohydrates. For which we proceeded in a first step to determine the conditions that improve phlorotannins extraction from algae such as seaweed drying temperature, parameters extraction and identification of compounds. In a second stage production carbohydrate active enzymes, alginate lyase, fucoidanase and 1,3-β-D-glucanase was optimized from microorganisms associated with marine macroalgae, to be employed subsequently in the enzymatic pretreatment of M. pyrifera. In a third stage of simultaneous extraction conditions of carbohydrate and phlorotannins was determined from M. pyrifera incorporating the previous stage enzymatic pretreatment. Finally, the separation of phlorotannins was studied from the final extract using macroporous resins. Evaluation of these stages allowed to determine that an enzymatic pretreatment with carbohydrate active enzymes, alginate, fucoidanasa and 1,3-β-D-glucanase produced by the marine fungus Alternaria sp, at 25°C for 36 hours pH 7.0 and algae/enzyme extract of 1/20, followed by alkaline extraction of the solid phase with 0.5 N NaOH at 100°C for 180 min in a solid/liquid ratio of 1/20 allowed obtain a final extract with a concentration 452 mg carbohydrate/g of alga and 2.14 mg phlorotannins/g of alga, which represents a specific extraction yield of 89.6% for carbohydrates and 21.4% for phlorotannins. Subsequently, the use of macroporous resin XAD- 16N allowed separation of the 42% of phlorotannins from the extract. Finally, the enriched fraction with phlorotannins was lyophilized presenting a concentration of 14.2 mg phlorotannins/g lyophilized.