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Professor Guidedc.contributor.advisorAlcaíno Gorman, Jennifer
Professor Guidedc.contributor.advisorCifuentes Guzmán, Víctor
Authordc.contributor.authorGárate Castro, Carla 
Associate professordc.contributor.otherStange Klein, Claudia
Associate professordc.contributor.otherOrlando, Julieta
Admission datedc.date.accessioned2017-05-30T17:01:48Z
Available datedc.date.available2017-05-30T17:01:48Z
Publication datedc.date.issued2017-05
Identifierdc.identifier.urihttps://repositorio.uchile.cl/handle/2250/144145
General notedc.descriptionSeminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniería en Biotecnología Moleculares_ES
Abstractdc.description.abstractXanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza astaxantina, un carotenoide de interés biotecnológico. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. La regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles se encuentran relacionadas. A su vez, ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. En el núcleo, los niveles de Sre1N son regulados por la proteína Ofd1 de manera oxígeno-dependiente, ya que esta proteína inhibe la unión de Sre1N al DNA y promueve su degradación proteosómica en presencia de oxígeno. El objetivo de este trabajo fue caracterizar y estudiar el posible gen de Ofd1 de X. dendrorhous mediante la construcción de cepas que carecen de dicho gen y ensayos de complementación en S. pombe. Mediante análisis bioinformático se identificó el posible gen OFD1 de X. dendrorhous, se dedujo la proteína y se realizó un modelo tridimensional por homología. Se comprobó la conservación del motivo HXD/E…H en el sitio activo, característico de las 2-oxoglutarato oxigenasas. Se realizó la deleción del gen OFD1 en tres cepas de X. dendrorhous: CBS-6938 (silvestre), CBS-cyp61- (mutante que no produce ergosterol y sobre produce carotenoides) y CBS-SRE1N (mutante que expresa solo la forma activa del factor de transcripción Sre1). Se evaluó el fenotipo de las mutantes Δofd1 respecto a sus parentales mediante análisis de carotenoides y esteroles totales por espectrofotometría, en tanto la composición de ambos tipos de xii metabolitos se determinó por RP-HPLC. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGR, el cual posiblemente es regulado por Sre1 en X. dendrorhous. Además, se estudió el fenotipo de crecimiento de la levadura en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol, en la presencia de cloruro de cobalto (compuesto que imita las condiciones de hipoxia) y en anaerobiosis. Los resultados indican que el producto génico de OFD1 no regularía los niveles de Sre1N en el núcleo debido a que no hubo cambio de fenotipo en ningún caso, por lo que OFD1 no participaría en la vía SREBP de X. dendrorhous. Adicionalmente, los ensayos de complementación heteróloga del gen OFD1 de X. dendrorhous en una cepa mutante para este gen en S. pombe, también indican que Ofd1 de X. dendrorhous no regularía los niveles de Sre1N, ya que no se observaron cambios en los niveles de Sre1N de S. pombe mediante Western blot. En conclusión, el gen OFD1 de X. dendrorhous no participa en la regulación del factor transcripcional Sre1N como se había planteado. Posiblemente exista otro mecanismo de regulación aún no descrito.es_ES
Abstractdc.description.abstractXanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes astaxanthin, a carotenoid of biotechnological interest. The astaxanthin synthesis is produced through mevalonate pathway metabolites, which are also necessary for sterol synthesis. The regulation of the carotenoid and sterol biosynthesis is related. At the same time, both pathways have been shown to be regulated by the SREBP pathway, which in mammal cells controls cholesterol levels. In fungi as well as in the yeast Schizosaccharomyces pombe the SREBP pathway is conserved. Particularly in the yeast, the transcription factor Sre1N regulates the sterol synthesis and the hypoxia response. In the nucleus, the levels of Sre1N are controlled by the Ofd1 protein in an oxygen-dependent way, due to the fact that this protein acts inhibiting the binding of Sre1N to DNA and promoting its proteosomal degradation under oxygen availability. The aim of this work was to characterize and study the possible Ofd1 gene in X. dendrorhous through strain construction lacking this gene and complementation assays in S. pombe. Bioinformatic analysis shown the possible X. dendrorhous OFD1 gene, the protein was deduced and a three-dimensional homology model was performed. The 2-oxoglutarate oxygenases characteristic motif HXD/E ... H was identified at the active site. Deletion of the OFD1 gene was done in three X. dendrorhous strains: CBS-6938 (wild-type), CBS-cyp61- (mutant that does not produce ergosterol and over produces carotenoids) and CBS-SRE1N (mutant expressing only the active form of transcription factor Sre1). Carotenoid and total sterol content was measured spectrophotometrically, while carotenoid and total sterol composition was determined by RP-HPLC. Expression analysis of HMGR gene, which is possibly regulated by Sre1 in X. dendrorhous, was also performed by RT-qPCR. In addition, the phenotype of the yeast growing in the xiv presence of the azole clotrimazole and ketoconazole, was studied in the presence of cobalt chloride (simulating hypoxic conditions) and in anaerobiosis. The results indicate that the OFD1 gene product would not regulate the levels of Sre1N in the nucleus because there was no change in yeast phenotype, so that OFD1 would not participate in the X. dendrorhous SREBP pathway. In addition, heterologous complementation assays of X. dendrorhous OFD1 gene in a mutant strain for this gene in S. pombe also indicate that X. dendrorhous Ofd1 would not regulate Sre1N levels, due to the fact that no changes were observed in the levels of S. pombe Sre1N by Western blot. In conclusion, the OFD1 gene of X. dendrorhous does not participate in the regulation of Sre1N transcription factor as was previously proposed. There may be another regulation mechanism not described yet.es_ES
Patrocinadordc.description.sponsorshipProyecto FONDECYT 1160202es_ES
Lenguagedc.language.isoeses_ES
Publisherdc.publisherUniversidad de Chilees_ES
Type of licensedc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile*
Link to Licensedc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/*
Keywordsdc.subjectEsteroleses_ES
Keywordsdc.subjectXanthophyllomyces dendrorhouses_ES
Keywordsdc.subjectAstaxantinaes_ES
Area Temáticadc.subject.otherMicrobiologíaes_ES
Títulodc.titleEstudio y caracterización del gen OFD1 de la levadura carotenogénica Xanthophyllomyces dendrorhouses_ES
Document typedc.typeTesises_ES
Catalogueruchile.catalogadorarmes_ES
Departmentuchile.departamentoEscuela de Pregradoes_ES
Facultyuchile.facultadFacultad de Cienciases_ES


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