Transformación estable de Daucus carota con los genes carotenogénicos DcPsy1 y DcPsy2 y la localización subcelular de DcPSY1

Abstract

Los carotenoides son compuestos isoprenoides que en plantas participan durante la fotosíntesis como pigmentos accesorios, protegen contra el daño foto-oxidativo y son precursores del ácido abscísico. En mamíferos los carotenoides son la principal fuente para la síntesis de vitamina A, además de actuar como antioxidantes. Debido a esta vital importancia para plantas y humanos es que se ha enfocado el estudio en la ruta metabólica con el fin de aumentar la cantidad de carotenoides en los alimentos de consumo humano. Se ha descrito que, en la ruta de biosíntesis de carotenoides, la primera enzima de la ruta llamada fitoeno sintasa (PSY) es un punto clave y altamente regulado. En Daucus carota, nuestro modelo de estudio, se han descrito dos genes que codifican a PSY, DcPsy1 y DcPsy2. Estos genes se expresan diferencialmente en hojas y raíz durante el desarrollo de la planta, y además se ha determinado que la región promotora del gen DcPsy2 presenta elementos en cis regulados por luz, fitohormonas y estrés abiótico. Se ha evidenciado la funcionalidad de estos dos genes in vivo al sobreexpresarlos en Nicotiana tabacum, donde promueven un aumento de carotenoides. Sin embargo, no se ha determinado si en la propia D. carota, ambos genes realmente participan en la biosíntesis de carotenoides en hojas y/o raíz, ya que podrían estar cumpliendo una función órgano específica, como sucede en otras plantas. En este seminario de título, se transformaron explantes de D. carota con vectores que permiten la sobreexpresión del gen DcPsy1 y DcPsy2, con el fin de obtener plantas transgénicas que serán utilizadas en futuros análisis de expresión y acumulación de carotenoides. Se obtuvieron exitosamente 11 líneas transgénicas de plantas de D. carota transformadas con el vector que permite la sobreexpresión del gen DcPsy1 y 7 líneas transgénicas de plantas transformadas con el vector para la sobreexpresión del gen DcPsy2. Además, por medio de la expresión en hojas de tabaco de una proteína de fusión entre el producto del gen DcPsy1 y la proteína fluorescente YFP (PSY1:YFP), se determinó que la localización subcelular de la proteína PSY1 es en plastidio. De este modo se comprobó su correcta localización subcelular, lo que aporta un antecedente importante sobre su funcionalidad, dado que los carotenoides se producen en los plastidios de células vegetales.

Carotenoids are isoprenoid compounds that fulfill important functions in plants. They act as accessory pigments during photosynthesis, protect cells against photooxidative damage and are precursors of abscisic acid. In mammals, carotenoids are the main source for the synthesis of vitamin A and have very powerful antioxidant properties. Due to these characteristics, since several years the studies have focused on modifying the metabolic pathway in order to increase the amount of carotenoids in food for human consumption. It has been described that, phytoene synthase (PSY), the first enzyme in the pathway, is a key point of carotenoid synthesis regulation. In Daucus carota, our plant model, two genes coding for PSY have been described, DcPsy1 and DcPsy2. These genes are differentially expressed in leaves and root during plant development. Also, DcPsy2, and not DcPsy1, responds to ABA which correlates with the presence of cis elements that are regulated by light, phytohormones and abiotic stress that are present in the DcPsy2 promoter. The functionality of these two genes has been evidenced in vivo by heterologous expression in Nicotiana tabacum, where they promote an increase of carotenoids. However, it has not been determined in D. carota itself, if both genes actually participate in the biosynthesis of carotenoids in leaves and/or root, since they could be fulfilling different functions in the plant in a specific organ way, as has been reported for other plants. In this work, explants of D. carota were transformed with vectors for DcPsy1 and DcPsy2 overexpression, to obtain transgenic plants that will be used in future functional analysis. We successfully obtained 11 transgenic lines of D. carota plants transformed with the vector for DcPsy1 overexpression and 7 transgenic lines of plants transformed to overexpress DcPsy2 gene. In addition, we generated a construct for DcPsy1 subcellular localization. A fusion protein between the product of the DcPsy1 gene and the fluorescent protein YFP (PSY1:YFP), let us to conclude that DcPSY1 protein has a plastidial localization. This result provides arguments about its functionality because carotenogenic enzymes are located in plant plastids were carotenoids are produced.