Modulación epigenética de RUNX2 en células troncales mesenquimáticas humanas de la gelatina de Wharton mediante inhibición farmacológica

Abstract

Anualmente se producen cerca de 9 millones de fracturas por fragilidad ósea en el mundo. El hueso es el segundo tejido con mayor demanda de trasplantes en el sistema de salud, en donde se emplean injertos autógenos y alógenos. Ante este escenario, el desarrollo de injertos óseos biocompatibles utilizando células troncales adultas para la optimización de la regeneración ósea es una solución con enorme potencial biomédico. En este trabajo se propuso aumentar el potencial osteoblástico de células madre mesenquimáticas derivadas de la gelatina de Wharton (WJ-MSC), a través de la pérdida de función de JARID1B, represor epigenético del gen maestro RUNX2. En investigaciones antecedentes al seminario de titulo, se demostró que el silenciamiento de JARID1B en células C2C12 es capaz de incrementar la expresión de RUNX2-P57. Además, se logró establecer que el estado epigenético de los promotores de RUNX2 y SP7, en cuya regulación participa JARID1B como demetilasa de histonas, posee un rol fundamental en la mantención del limitado potencial osteoblástico de WJ-MSC. En este seminario de título se establecieron las condiciones experimentales para el tratamiento de WJ-MSC con el fármaco PBIT, un inhibidor de la actividad de JARID1B, durante la diferenciación osteoblástica. El tratamiento con PBIT resultó en un aumento significativo de la expresión de RUNX2-P57, en conjunto con el enriquecimiento de la marca epigenética H3K4me3 en el promotor P1 de RUNX2. Sin embargo, no se observaron diferencias con respecto a la mineralización por deposición de sales de calcio en etapas tardías de la diferenciación en respuesta al tratamiento farmacológico. El silenciamiento de JARID1B resultó en un aumento de la expresión de RUNX2-P57, además del enriquecimiento de las marcas epigenéticas H3K4me3 y H3K27Ac en su promotor. xiii En concordancia con estudios previos realizados en el laboratorio, se concluye que las WJ-MSC poseen un potencial osteoblástico restringido, evidenciado por la activación de genes osteoblásticos tempranos y no de marcadores tardíos, frente a la inducción a diferenciación osteoblástica. Se reafirma así la propuesta de una barrera epigenética en RUNX2, que restringe el compromiso a linaje osteoblástico en WJ-MSC, dada por el origen ontogénico temprano de estas MSC, directamente relacionado con su potencial de desarrollo. La modulación epigenética en WJ-MSC, por medio de JARID1B, es capaz de incrementar significativamente la expresión de genes osteoblásticos tempranos, no así de potenciar la formación de osteoblastos y el proceso de mineralización. Proponemos el co-cultivo de WJ-MSC tratadas con PBIT sobre matrices biocompatibles, además de la adición de otros inductores de diferenciación osteoblástica, como BMP2, al medio de cultivo. Asimismo, se sugiere ensayar la adición de las moléculas de la vía de señalización Wnt, WISP1 y sFRP4, con el objetivo de incrementar el potencial osteoblástico de cultivos primarios de WJ-MSC. En definitiva, a pesar del enorme potencial terapéutico de las WJ-MSC, es necesario un mayor entendimiento de los mecanismos celulares que limitan el compromiso a linaje óseo, particularmente en relación a la barrera a nivel epigenético propuesta a raíz de nuestro trabajo con WJ-MSC, para respaldar sólidamente su uso en ingeniería de tejidos óseos y terapia regenerativa.

Worldwide, over 9 million bone fragility fractures are estimated to occur per year. Bone is the second most demanded tissue for transplantation in the health system, where autologous and allogenic grafts are used. In this scenario, the development of biocompatible bone grafts using adult stem cells for the optimization of bone regeneration is a solution with enormous potential in biomedicine. In this work, we aimed to increase the osteoblastic potential of mesenchymal stem cells derived from the Wharton’s Jelly of the umbilical cord (WJ-MSC), through the loss of function of JARID1B, an epigenetic repressor of the master gene RUNX2. In previous work, it was demonstrated that knockdown of JARID1B in the cell line C2C12 is capable of increasing RUNX2-P57 expression. Also, it was established that the epigenetic state of the promoters of RUNX2 and SP7 has a fundamental role in the maintenance of the limited osteoblastic potential of WJ-MSC. In the present thesis, we set the experimental conditions for the treatment of WJ-MSC in osteoblastic differentiation with the drug PBIT, an inhibitor of the activity of JARID1B. PBIT treatment resulted in a significant increase in RUNX2-P57 expression, along with the enrichment of the epigenetic mark H3K4me3 at RUNX2 P1 promoter. However, there were no differences in mineralization due to calcium salts deposition in late stages of osteoblastic differentiation, in response to pharmacological treatment. Knockdown of JARID1B resulted in an increase in RUNX2-P57 expression and in the enrichment of the epigenetic marks H3K4me3 and H3K27Ac at RUNX2 promoter. In concordance with previous research from our laboratory, we conclude that WJ-MSC have a restricted osteoblastic potential, as evidenced by the activation of early osteoblastic genes, but not late osteoblatic markers, when induced to osteoblastic differentiation. The proposal of an epigenetic barrier in RUNX2 that restricts the xv commitment to the osteoblastic lineage in WJ-MSC is then reaffirmed. It is given by the early ontogenetic origin of this MSC and directly related with its developmental potential. Epigenetic modulation in WJ-MSC through JARID1B is capable of significantly increasing the expression of early osteoblastic genes, but it is not capable of enhancing osteoblasts formation and mineralization. We propose the culture of PBIT-treated WJ-MSC over biocompatible matrix and the addition of other osteoblastic differentiation inducers such as BMP2. Similarly, we suggest testing the adittion of molecules from the Wnt signaling pathway, like WISP and sFRP4, to increase the osteoblastic potential in primary cultures of WJ-MSC. In summary, and despite their extensive therapeutic potential, a deeper understanding of the cellular mechanisms underlying the limitation to the commitment of WJ-MSC to the bone lineage is needed to strongly support its application in bone tissue engineering and regenerative therapy, particularly in respect to the epigenetic barrier proposed in the light of our work with WJ-MSC primary cultures.