Estudio de la unión de cobre a la chaperona periplasmática CusF de Acidithiobacillus ferrooxidans: efecto del pH y del cambio de la Metionina 66 por Histidina mediante mutación sitio-dirigida.

Abstract

La chaperona bacteriana periplasmática CusF es parte del sistema de resistencia a cobre CusCFBA. CusF une cobre (I) en el periplasma bacteriano mediante una histidina y dos metioninas muy conservadas en las bacterias. En Acidithiobacillus ferrooxidans, la histidina del sitio de unión a cobre de CusFAf se encuentra sustituída por metionina. Se ha determinado que a pesar que la afinidad de la histidina por cobre es mayor que la de la metionina a pH neutro, esta última presenta una mayor afinidad por cobre a pH ácido. Siendo A. ferrooxidans una bacteria que vive en ambientes ácidos, esta sustitución podría estar relacionada con la adaptación al periplasma ácido de la bacteria. Se analizó bioinformáticamente el sitio de unión a cobre de CusF para determinar las especies en las que se encuentra esta sustitución. Se encontró que sólo el género Acidithiobacillus presenta esta sustitución. Adicionalmente se midió la unión de cobre a la CusF de A. ferrooxidans y el efecto que tiene esta sustitución. Para ello se clonó el gen cusF3Af en E. coli y se realizó una mutación sitio dirigida de su metionina 66 cambiándola por histidina. Luego de expresar y purificar ambas proteínas (silvestre y mutada) se midió in vitro su capacidad de unir cobre tanto a pH ácido como neutro. A pH 7, la CusF3 de A. ferrooxidans presentó unión a cobre con un valor experimental de 0.7 átomos de cobre por proteína mientras que la mutante M66H unió 0.3 átomos de cobre por proteína (la misma cantidad de cobre que el control). A pH ácido no fue posible medir la unión de cobre con el método utilizado. Se concluye que la sustitución de histidina por metionina en la CusF3Af es exclusiva del género Acidithiobacillus y que esta chaperona tiene capacidad de unir cobre a pH neutro.

The periplasmatic metallochaperone CusF is part of the CusCFBA copper resistance system. CusF binds Cu(I) through a conserved site consisting of 1 histidine and 2 methionines. In Acidithiobacillus ferrooxidans, this histidine present in the position 66 of CusFAf is found substitued by a methionine. It has been determined that while the affinity of copper for histidine is higher than that for methionine at neutral pH, the latter has higher affinity for the metal at low pH. Since A. ferrooxidans lives in acidic environments, it is proposed that this subsitution could be an adaptation to the acid periplasm of this bacterium. The copper binding site of CusF was analyzed bioinformatically to determine the species in which this subsitution is found. This substitution was only present in the CusF of species from the genus Acidithiobacillus. Additionally, copper binding capacity of the A. ferrooxidans CusF was measured, and the effect of this substitution was investigated. To fulfill that purpose, the cusF3Af gene was cloned into E. coli and a site directed mutation was performed to replace methionine 66 with histidine. Both wild type and mutated proteins were expressed and purified to measure in vitro their copper binding capacity at both neutral and acid pH. A copper binding capacity of 0,7 copper atoms per protein was found for the wild type CusF3Af, while the M66H mutant was able to bind 0,3 copper atoms per protein (the same amount of copper present in the negative control). It was not possible to perform this measurement under acidic conditions. It was concluded that the subsitution of histidine for methionine in CusF3Af is exclusive of the Acidithiobacillus genus, and that this copper chaperone has the capacity to bind copper at neutral pH.