Identificación, selección y evaluación de la resistencia a oídio (E. necator) en plantas de vid (Vitis vinifera) portadoras de RUN1 y REN1

Abstract

La vid (Vitis vinífera) es uno de los cultivos más importantes dentro de las plantas frutícolas. En los viñedos estas se encuentran sometidas constantemente a patógenos que pueden afectar en la producción y calidad final del fruto destacando el hongo filamentoso Erysiphe necátor agente causal del oídio de la vid. Actualmente la mayor parte de las variedades que se comercializan para la producción de uva de mesa y vino son afectadas por este patógeno. RUN1 y REN1 son dos loci de carácter dominante estudiados en variedades no comerciales de vid, que por si solos confieren resistencia contra esta enfermedad, ambos traducirían para proteínas capaces de reconocer en alguna etapa las alteraciones que produce el patógeno sobre la planta, generando una respuesta de defensa efectiva contra la infección del hongo, por lo que la piramidación de ambos loci en una variedad de interés podría mejorar su defensa, haciéndola más efectiva y duradera en el tiempo. Esto permitiría en los viñedos disminuir la cantidad de químicos necesarios que se utilizan actualmente para combatir este hongo. En este trabajo se identificaron y estudiaron variedades portadoras de RUN1 y REN1 provenientes de iterativos retrocruzamientos entre diversas variedades comerciales y parentales resistentes que portaban uno de estos loci. Para conocer la respuesta que se generó a partir de la piramidación, se evaluó y caracterizó la defensa frente a la infección de oídio bajo condiciones de invernadero. Para identificar las líneas positivas para RUN1 se utilizaron dos parejas de partidores dirigidos al gen MrRUN1 presente dentro del locus, mientras que para identificar aquellas vides portadoras de REN1 se usaron marcadores moleculares tipo microsatélites dirigidas a dos regiones que segregan junto con la resistencia. Se analizaron los resultados, obteniendo plantas portadoras de ningún, uno o ambos loci. Mediante análisis de tinciones histológicas y microcortes 2 transversales de plantas infectadas, se logró observar una fuerte producción de especies reactivas de oxígeno y muerte celular en aquellas plantas portadoras de por lo menos algún loci, teniendo un efecto mayor en aquellas líneas que poseían ambos. Para determinar si la presencia de estos loci provocaba un cambio en la inducción de hormonas relacionadas a procesos de defensa, se midieron las concentraciones de ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y ácido abscísico (ABA) a través de HPLC, observando diferentes cambios según el genotipo infectado. Para saber si existía algún efecto provocado por estos loci en la inducción de genes que participan en el proceso se realizó qPCR de algunos genes relacionados con el proceso infectivo o la defensa, así para todos los genotipos se vio un aumento en la inducción de MLO7 (MLO-like protein 7), gen involucrado en la susceptibilidad de la enfermedad, mientras que para PEN1 (PENETRATION 1), gen involucrado en procesos de resistencia, se observó un aumento mayor en aquellas líneas resistentes. Estos resultados sugieren una respuesta efectiva, robusta y contenida frente a la infección del hongo en aquellas líneas portadoras de ambos loci.

The vid (Vitis vinífera) is one of the most important crops among fruit plants. At the vineyards grapevines are constantly submitted to different pathogenic microorganisms that can affect the production and the final quality of fruit. One of the most important pathogens that affect its growth is the filamentous fungus Erysiphe necator, which causes the disease called powdery mildew, taking the nutrients from green tissue and berries. Currently, most of the marketable varieties for table grapes and wine production are affected by this pathogen. RUN1 and REN1 are two dominant loci studied in non commercial vineyards varieties, which by themselves confer resistance against powdery mildew. It has been suggested that both loci codify for proteins capable of recognizing the alterations produced by the pathogen on the plant in certain infection stage, generating an effective defence response against fungal infection. Therefore, the pyramiding of the two loci in a variety of commercial interest could improve their defense, making it most effective and lasting over time. This would lead to a decrease the amount of chemicals compounds currently used to combat this fungus in vineyards. In this work, RUN1 and REN1 plant carriers were identified and studied from iterative backcrosses between several commercial and resistant varieties that carried one of these loci. In order to analyze the defense response generated from the pyramiding plants, it was characterized against the infection of powdery mildew under greenhouse conditions. To identify the RUN1 positive lines, two pairs of primers directed to the MrRUN1 gene (located within the locus) were used; while to identify those vines carrying the REN1 locus, molecular markers (SSR) were used, identifying two regions that segregate 4 together with the resistance. We obtained plants carrying none, one or both loci. Through histological staining and transverse microcutting of infected plants, it was possible to observe a strong production of reactive oxygen species (ROS) and cell death in the plants carrying at least one locus, finding a greater effect in those lines that carry both loci. To determine if the presence of these loci changes the profile of hormones related to defense processes, the concentrations of salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA) were measured through HPLC. We found differences according to the infected genotype. To find out if there was any effect caused by these loci in the induction of genes involved in the process, qPCR of some genes related to infection or defense was performed. We found increased induction of MLO7 (MLO-like protein 7) in all genotypes, involved in the susceptibility of the disease, whereas for PEN1 (PENETRATION 1), a gene involved in resistance processes, a greater induction was observed only in resistant lines. These results suggest an effective, robust and contained response to fungal infection in those lines carrying both loci