Regulación de la autofagia por GLP-1 en células musculareslisas vasculares (VSMC)

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo. Desregulaciones en el flujo autofágico y en la desdiferenciación de células musculares lisas vasculares (VSMC) se han asociado con diferentes enfermedades cardiovasculares. En la aterosclerosis, una de las patologías cardiovasculares más importante, las VSMC desempeñan un papel fundamental cuando cambian su fenotipo desde uno contráctil y quiescente a otro proliferativo, migratorio y sintético. Se ha descrito que el cambio fenotípico de las VSMC es un proceso dependiente de autofagia. Por lo tanto, encontrar nuevos mecanismos que regulen este cambio fenotípico es fundamental para generar nuevas alternativas para tratar las enfermedades cardiovasculares. Dentro de esta búsqueda, el péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), una hormona de la familia de las incretinas, surge como un potencial inhibidor de este proceso. Nuestro laboratorio ha descrito que esta incretina, al unirse a su receptor, activa a la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA). Se ha descrito a la PKA como un regulador negativo de la autofagia, ya que fosforila e inhibe a la proteína asociada a microtúbulo 1A/1B cadena liviana 3B, conocida también como LC3, una proteína autofágica esencial que también se usa como marcadora de la autofagia. Además, tanto en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 como en pacientes sanos, se ha comprobado la acción beneficiosa de GLP-1 sobre la aterosclerosis. Por estos antecedentes, proponemos que GLP-1 inhibe la autofagia a través de la fosforilación de LC3 por PKA en VSMC. La línea celular de aorta de rata, A7r5, se cultivó en condiciones basales en medio completo suplementado con 10% suero fetal bovino. La autofagia se indujo con un medio de cultivo carente de glucosa, el RPMI 1640. Además, las células A7r5 se estimularon con GLP-1 y/o H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromofenil)alilamino)etil)-isoquinolin-5- sulfonamida], inhibidor de PKA. La autofagia se evaluó midiendo los niveles proteicos de LC3 I y LC3 II por western blot y por la formación de autofagosomas. Los autofagosomas se visualizaron mediante la transducción de VSMC con un adenovirus que sobreexpresa xii LC3 acoplada a la proteína fluorescente verde con una multiplicidad de infección de 180 y microscopía confocal. El flujo autofágico se determinó usando cloroquina. Nuestros resultados sugieren que GLP-1 disminuye el flujo autofágico en condiciones basales y de privación de glucosa. Además, GLP-1 disminuyó el número de autofagosomas por célula en la autofagia basal, pero no durante la privación de glucosa. Asimismo, se determinó que PKA participaría en los efectos generados por GLP-1 en la autofagia basal, pero no en la autofagia inducida por privación de glucosa. Finalmente, GLP-1 no aumenta la fosforilación de LC3. Este resultado sugiere que la inhibición de la autofagia por GLP-1 mediante PKA no ocurría por fosforilación de LC3. Por lo tanto, el efecto de GLP-1 en la inhibición de la autofagia en VSMC vía PKA, se suma a los antecedentes que postulan a GLP-1 como un promisorio regulador de la aterosclerosis y de otras enfermedades cardiovasculares.

Autophagy regulation by GLP-1 in vascular smooth muscle cells (VSMC) Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Deregulation in both autophagic flux and vascular smooth muscle cell (VSMC) dedifferentiation have been associated with different cardiovascular diseases. In atherosclerosis, one of the most important cardiovascular pathology, VSMC play a critical role when they change from a contractile and quiescent phenotype to a proliferative, migratory and synthetic phenotype. It was described that this phenotypic change is an autophagy-dependent process. Hence, finding new mechanisms to regulate this phenotypic change is critical to generate new alternatives to treat cardiovascular diseases. In this investigation, glucagon like peptide 1 (GLP-1) arises as a potential inhibitor of this process. Our laboratory has described that this incretin, upon binding to its receptor, activates the cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA). PKA was described as a negative autophagy regulator, because it phosphorylates and inhibits the microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B, also known as LC3, an essential autophagic protein also used as an autophagy marker. Besides, in both diabetic patients and healthy patients, the beneficial effects of GLP-1 on atherosclerosis has been demonstrated. Taking the above in consideration, we proposed that GLP-1 inhibits autophagy through a PKA induced LC3 phosphorylation in VSMC. The aortic VSMC cell line A7r5 were cultivated in basal condition with complte culture medium + 10% fetal bovine serum. Autophagy was induced with a glucose deprived culture medium, RPMI 1640. Also, A7r5 cells were stimulated with GLP-1, and/or H-89 [(E)-N-(2-(3-(4-bromophenyl)alylamino)ethyl)-isoquinoline-5- sulfonamide], a PKA inhibitor.). Autophagy was assessed by LC3 I and LC3 II levels using by western blot and by autophagosome formation. Autophagosomes were visualized by adenoviral transduction of LC3 coupled to green fluorescent protein using a xiv multiplicity of infection of 180 and confocal microscopy. Autophagic flux was evaluated using chloroquine. Our results suggest that GLP-1 inhibits autophagic flux under basal and glucose deprivation conditions. In addition, GLP-1 decreased the number of autophagosomes per cell in basal autophagy, but not in glucose deprivation-induced autophagy. Moreover, a PKA participation was demonstrated in the GLP-1-dependent effects on basal autophagy, but not on glucose deprivation-induced autophagy. Finally, GLP-1 did not increase LC3 phosphorylation. This result suggest that the GLP-1-dependent autophagy inhibition would not occur through LC3 phosphorylation. Therefore, the GLP-1 effect on autophagy inhibition in VSMC via PKA adds to the background information which suggests GLP-1 as a promising regulator of atherosclerosis and other cardiovascular diseases.