Construcción y estudio funcional de mutantes de la biosíntesis de ergosterol de la levadura carotenogénica Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

La levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es capaz de sintetizar astaxantina, un carotenoide utilizado en la industria acuícola. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. El ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) es un componente de las membranas celulares de los hongos y el producto final de la ruta de esteroles. Ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. Se ha visto que la regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles está relacionada, ya que la deleción del gen CYP61 que participa en la síntesis de ergosterol (mutante CBS-6938cyp61-), resultó en un fenotipo que sobreproduce carotenoides. Estas observaciones podrían ser explicadas por un efecto negativo del ergosterol sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides y esteroles, especialmente a nivel de la transcripción de genes de la ruta del mevalonato como el gen HMGR. Es así como en este seminario de título se planteó poner a prueba dicha hipótesis construyendo otros mutantes de la biosíntesis de ergosterol (mutantes de los genes ERG3 y ERG4) para evaluar si estos mantienen el mismo fenotipo que la mutante CBS-6938cyp61- (ausencia de ergosterol y sobreproducción de carotenoides). Mediante análisis bioinformático se identificaron los genes ERG3 y ERG4 de X. dendrorhous y se construyeron los plásmidos para la deleción de ambos genes en la cepa CBS-6938, obteniendo las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. Se evaluó el fenotipo de las mutantes con respecto a la cepa CBS-6938 mediante análisis xiii de carotenoides y esteroles totales, obrservando un aumento en los niveles de esteroles, aunque no se afectó el nivel de carotenoides totales. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGS, el cual posiblemente es regulado por vía SREBP en X. dendrorhous, donde solo observó un aumento en el nivel de transcrito de este gen en la mutante del gen ERG4. Además, las cepas mutantes presentaron una disminución en el crecimiento en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol y el antifúngico Anfotericina B. Los resultados indican que la via SREBP no se encuentra activa en las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. En conclusión, no es la ausencia de ergosterol lo que estaría activando la via SREBP, sino más bien la acumulación de esteroles específicos como sería el caso la cepa CBS-6938cyp61-.

The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid used in the aquaculture industry. This pigment is synthesized from metabolites of the mevalonate pathway, which are also necessary for the synthesis of sterols. Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) is a component of fungal cell membranes and the final product of the sterol pathway. Both routes have been reported to be regulated by the SREBP pathway, which in mammals regulates cholesterol levels in cells. In fungi the SREBP pathway is conserved, as in the yeast Schizosaccharomyces pombe where the transcription factor Sre1N regulates the synthesis of sterols and the response to hypoxia. It has been found that the regulation of the biosynthetic pathways of carotenoids and sterols is related, since the deletion of the CYP61 gene involved in the synthesis of ergosterol (mutant CBS-6938cyp61-), resulted in a phenotype that overproduces carotenoids. These observations could be explained by a negative effect of ergosterol on the regulation of the biosynthesis of carotenoids and sterols, especially at the level of the transcription of genes of the mevalonate route such as the HMGR gene. Thus, in this work it was proposed to test this hypothesis by the mutation other mutants of ergosterol biosynthesis (mutants of the ERG3 and ERG4 genes) to evaluate whether they maintain the same phenotype as the mutant CBS-6938cyp61- (absence of ergosterol and overproduction of carotenoids). By bioinformatic analysis, the ERG3 and ERG4 genes of X. dendrorhous were identified and the plasmids were constructed for the deletion of both genes in strain CBS-6938, obtaining the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. The phenotype of the mutants was evaluated with respect to the aforementioned strain CBS-6938 by analysis xv of carotenoids production and total sterols, were an increase in sterol levels was observed although no change was observed in total carotenoids. . An expression analysis was also performed by RT-qPCR of the HMGS gene, which is suggested to be regulated via SREBP in X. dendrorhous. In this case, the mutants presented only increase in the transcript level in the mutant of ERG4. In addition, a decrease in the growth of the mutant strains was observed in the presence of the azoles clotrimazole and ketoconazole and the antifungal agent Amphotericin B. The results indicate that the SREBP pathway is not active in the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. In conclusion, it is not the absence of ergosterol that would be activating the SREBP pathway, but rather the accumulation of specific sterols as would be the case with the strain CBS-6938cyp61-.