Determinación del potencial de diferenciación tenogénica in vitro de celulas madre mesenquimáticas derivadas de medula ósea fetal equina

Abstract

Las células madre mesenquimáticas (MSC) son células multipotentes que pueden ser aisladas de diversas fuentes tisulares incluyendo médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA). Tanto su potencial de diferenciación como la producción de factores inmunomoduladores, regenerativos, angiogénicos y antibacterianos han generado gran expectativa en el último tiempo sobre el potencial uso de las MSC para el tratamiento de enfermedades tanto en medicina humana como veterinaria. La utilización de MSC en el equino, responde principalmente a la necesidad de tratar patologías asociadas a la actividad deportiva. Las MSC provenientes de tejido adulto equino han demostrado capacidad in vitro de diferenciación tenogénica al ser expuestas al factor BMP-12. En el caso de MSC de origen fetal, se ha reportado que estas células poseen un mayor potencial de proliferación y diferenciación comparado con MSC obtenidas desde tejidos adultos. Sin embargo, el potencial de diferenciación tenogénica de las MSC derivadas de médula ósea fetal equina no ha sido previamente evaluado. El objetivo del presente estudio es evaluar el potencial in vitro de diferenciación tenogénica de MSC obtenidas de la medula ósea fetal equina. MSC provenientes de la MO fetal equina fueron sembradas a una concentración de 23 x 105 células/cm2 bajo el efecto de tres dosis de BMP-12 (25, 50 y 100 ng/mL). La expresión de los genes marcadores de tendón SCX, COL1α1, TNMD y DCN fue evaluada los días 0 y 21. Posteriormente, se evaluó el efecto de una dosis (50 ng/mL) de BMP-12 durante el proceso de diferenciación tenogénica. En ambos experimentos no se apreciaron diferencias morfológicas tanto para células control, como tratadas con BMP-12. La expresión del marcador tenogénicos TNMD no fue detectada en MSC. En tanto, los niveles de mRNA de SCX disminuyeron (P<0,05) el día 21 de cultivo tanto en MSC no expuestas a BMP-12, como en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. Los niveles de mRNA de COL1α1 no fueron distintos (P>0,05) en MSC controles y en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. En comparación, los niveles de expresión relativa del gen DCN, aumentaron (P<0,05) en MSC tratadas con 25 ng/mL de BMP-12. En la evaluación del efecto temporal se detectó una disminución (P<0,05) de SCX el día 21 en comparación con el día 0 en MSC tratadas con BMP-12. La expresión relativa del gen COL1α1 no fue distinta (P>0,05) en MSC tratadas con BMP-12 versus el control no tratado durante los 21 días de cultivo y las células de día 0. Los niveles de mRNA de DCN aumentaron (P<0,05) el día 21 en MSC 2 tratadas con BMP-12, en comparación con el día 0. En conclusión, la suplementación con BMP-12 en MSC fetales equinas durante 21 días disminuye los niveles de mRNA de SCX, lo que a su vez no permitió activar la transcripción del gen TNMD, ni aumentar la expresión de COL1α1. El aumento en la expresión del marcador tenogénico DCN en MSC tratadas con BMP-12 sugiere que este factor indujo un progreso en el proceso de diferenciación hacia un estadio avanzado de diferenciación tenogénica.

Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells than can be isolated from diverse tissue sources including bone marrow (BM) and adipose tissue (AT). The differentiation and immunomodulatory potentials, and the production of trophic factors involved in regenerative, angiogenic and antibacterial activity have generated great expectative on the potential use of MSC for the treatment of diverse pathologies in veterinary and human medicine. The use of MSC in equine responds mainly to the need to treat pathologies associated with sports activities. MSC from adult tissue have proven the capacity for in vitro tenogenic differentiation when exposed to BMP-12 factor. In MSC from fetal origin it has been reported that these cells have a greater proliferation and differentiation potential compared with MSC from adult sources. However, the potential for tenogenic differentiation of MSC derived from equine foetal BM has not been previously reported. The objective of the present study was to evaluate the in vitro tenogenic differentiation potential of MSC derived from equine fetal BM. Cells were seeded at a 23 x 105 cells/cm2 under the effects of three doses of BMP-12 (25, 50 and 100 ng/mL). The expression from tenogenic marker genes SCX, COL1α1, TNMD and DCN was evaluated at days 0 and 21. Cell morphology and relative expression of genes was evaluated at days 7, 14 and 21, as well an immunofluorescence evaluation of COL1α1 on day 21. No morphological differences were observed for both control and cells treated with BMP-12. The tenogenic marker TNMD was not detected in MSC. Levels of SCX decreased (P<0.05) on day 21 for both control and cells treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. In comparison, mRNA levels of COL1α1 were not different (P>0.05) in MSC control and treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. DCN relative expression levels increased (P<0.05) in MSC treated with 25 ng/mL of BMP-12. In the evaluation of the temporary effect, SCX levels decrease (P<0.05) on day 21 compared to day 0 on MSC treated with BMP-12. During the 21 days of culture, COL1α1 relative expression was not different (P>0.05) in MSC treated with BMP-12 versus the untreated control. DCN mRNA levels increased (P<0.05) on day 21 in MSC treated with BMP-12 compared to day 0. In conclusion, reduction in mRNA levels of SCX after BMP-12 treatment for 21 days may have prevented the activation of the TNMD gen and the increment of COL1α1 expression. The increase in expression of the tenogenic marker DCN in MSC treated with BMP-12 suggests that this 4 factor may have induced a progress in the differentiation process until an advanced state of tenogenic differentiation.