Estudio de ligandos del receptor NKG2D de activación de células natural killer y de las citoquinas IL-10 e IL-12 en endometrio eutópico de mujeres con endometriosis

Abstract

La endometriosis es una enfermedad inflamatoria benigna que se caracteriza por la presencia y crecimiento de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina (ectópico), cuya etiología y fisiopatología permanece aún sin aclarar. Se ha demostrado que el endometrio eutópico de mujeres con endometriosis exhibe alteraciones moleculares, indicando que el defecto primario se encontraría en este tejido. Por otro lado, la desregulación del sistema inmune permite que las células endometriales que han llegado a la cavidad pélvica escapen de la vigilancia inmune, se implanten y proliferen, lo que favorece la formación de las lesiones ectópicas endometriales. Las células Natural Killer (NK) son linfocitos que participan en la inmunovigilancia y poseen un receptor de activación denominado NKG2D, el cual interactúa con diferentes ligandos (NKG2DL) expresados por células bajo estrés celular. Las interleuquinas (IL)-10 e IL-12 juegan un rol importante en la función inmunoreguladora, la cual involucra a macrófagos, linfocitos T y NK. Los niveles de NKG2DL, IL-10 e IL-12 en células endometriales del endometrio eutópico de mujeres con endometriosis no han sido estudiados hasta la fecha. Por lo tanto, en este trabajo, propusimos la siguiente hipótesis: “Durante el ciclo menstrual, en el endometrio eutópico de mujeres con endometriosis, los niveles de los ligandos del receptor NKG2D, activadores de las células Natural Killer (NK), se encuentran disminuidos, así como las citoquinas IL-10 e IL-12, lo que contribuye a la alterada respuesta inmunológica descrita en esta patología”. Para ello, se caracterizaron los niveles transcripcionales y la presencia de los ligandos MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 y ULBP-3 y de IL-10 e IL-12 en el endometrio eutópico de mujeres con y sin endometriosis durante el V ciclo menstrual, así como se evaluó el efecto del estradiol y prostaglandina E2 en células endometriales aisladas de pacientes y controles, simulando el microambiente estrogénico e inflamatorio descrito en el endometrio de las pacientes con endometriosis. Se evaluaron los niveles de mRNA por RT-PCR y los niveles proteicos por inmunohistoquímica (IHQ) y citometría de flujo. Se detectó la expresión de todos los NKG2DL estudiados, tanto al nivel de mRNA como proteico, en ambos grupos de endometrios durante el ciclo menstrual, encontrándose que los niveles de MICA aumentaron en la fase secretora media y tardía en el grupo control, pero su expresión no presentó diferencia significativa durante el ciclo menstrual de las pacientes. En contraste, la expresión de MICB aumentó en la fase secretora inicial, disminuyendo fuertemente al final del ciclo en las mujeres con endometriosis. Los niveles de mRNA de ULBP-3 fueron significativamente mayores en el endometrio eutópico de las pacientes comparado al grupo control durante la fase secretora media, mientras que los niveles de ULBP-2 aumentaron gradualmente hacia las etapas finales del ciclo menstrual en ambos grupos, y los niveles de ULBP-1 no se modificaron durante el ciclo menstrual. Muy bajos niveles de mRNA de IL-12p40 fueron detectados en el endometrio control durante el ciclo menstrual, a diferencia del endometrio de fase secretora media de endometriosis, cuyos niveles fueron significativamente mayores que el grupo control. Por el contrario, la proteína IL-12 fue localizada en forma focal, aumentando su presencia solamente en el endometrio control secretor tardío. En forma similar, los niveles de la proteína IL-10 aumentaron significativamente en el compartimiento estromal control de la fase secretora tardía, y disminuyó en endometriosis en comparación al grupo control. En células VI epiteliales aisladas de ambos grupos, se detectaron, al nivel proteico y transcripcional, los NKG2DL estudiados, encontrándose disminuidos en endometriosis comparados al grupo control. La presencia de estradiol y/o prostaglandina no modificó el nivel de mRNA de ningún ligando estudiado. En síntesis, hemos caracterizado, por primera vez, la expresión de los NKG2DL MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 y ULBP-3 en el endometrio normal y patológico durante el ciclo menstrual. El aumento sostenido de los niveles de MICA y ULBP-2 hacia la fase secretora tardía sugiere una mayor activación de células NK en el tejido pre-menstrual normal que coincide con una reducida expresión de MICB en endometriosis. Por otro lado, la expresión diferencial de ULBP-3 e IL-12 en los endometrios secretores de endometriosis, además de la fuerte disminución en la expresión de IL-10 en la fase secretora tardía, podrían estar favoreciendo la implantación ectópica de los debris endometriales que arriban a la cavidad pélvica. Estos resultados sugieren que los ligandos del receptor NKG2D, principalmente MICA y ULBP-2, como también IL-10 e IL-12, jugarían un papel importante en las etapas finales del ciclo menstrual, período en que el endometrio experimenta una exhaustiva remodelación, preparándose para la acogida embrionaria o, en su defecto, para su eliminación a través de la menstruación. Las diferencias observadas en el endometrio de mujeres con endometriosis podrían explicar, al menos en parte, la infertilidad, como también la capacidad del tejido menstrual de escapar a la inmunovigilancia, como ha sido descrito en estas pacientes.

Endometriosis is a benign inflammatory disease characterized by the presence and growth of endometrial tissue outside the uterus (ectopic), whose etiology and pathophysiology still remains unclear. It has been shown that the eutopic endometrium of women with endometriosis exhibits molecular alterations, indicating that the primary defect would be present in this tissue. On the other hand, deregulation of the immune system allows the endometrial cells that have reached the pelvic cavity to escape immune surveillance, which favors their implantation and proliferation, resulting in ectopic endometrial lesions. Natural Killer (NK) cells are innate lymphocytes that participate in immune surveillance. They express the activating receptor NKG2D, which interacts with different ligands (NKG2DL) on nucleated cells under cell stress. Interleukin (IL)-10 and IL-12 play a role in the immune regulatory function involving macrophages, T lymphocytes and NK cells. To date, the levels of NKG2DL, IL-10 and IL-12 on endometrial cells of the eutopic endometrium of women with endometriosis have not been described. Therefore, here we proposed the following hypothesis: "During the menstrual cycle, in the eutopic endometrium of women with endometriosis, the ligands of the NKG2D receptor, which activate natural killer (NK) cells, are decreased, as well as the cytokines IL-12 and IL-10, which contribute to the altered immune response described in this pathology". For this purpose, the transcriptional levels and the presence of MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 and ULBP-3 ligands and IL-10 and IL-12 were characterized in the eutopic endometrium of women with and without endometriosis during the menstrual cycle. We also evaluated the effect of estradiol and prostaglandin E2 in isolated endometrial cells from patients and controls, simulating the estrogenic and inflammatory microenvironment described in the endometrium of patients with endometriosis. The mRNA levels were evaluated by RT-PCR and the presence of proteins was assessed by immunohistochemistry (IHC) and flow cytometry. Both, mRNA and protein of all NKG2DL studied were detected in both groups of endometria during the menstrual cycle. MICA levels increased in the mid and the late secretory phases only in the endometrium of control individuals, although its expression did not show significant difference during all phases of the menstrual cycle in patients with endometriosis. In contrast, MICB expression increased in the early secretory phase and fell sharply in the late secretory phase only in the endometrium of women with endometriosis. The mRNA levels of ULBP-3 were significantly higher in the eutopic endometrium from patients compared to controls during the mid-secretory phase. In addition the mRNA levels of ULBP-2 gradually increased towards the end of the menstrual cycle, while ULBP-1 did not change during the menstrual cycle in both groups of individuals. Very low levels of IL-12p40 mRNA were detected in the control endometrium during the menstrual cycle, which differed from the mid secretory phase in the endometrium of women with endometriosis, which presented significantly higher IL-12p40 messenger levels than the control group. In contrast, IL-12 protein levels were focally localized in the endometrial tissue, and its expression increased significantly only in the late secretory control endometrium. Similarly, the IL-10 protein increased significantly in the late secretory phase in the control stromal and epithelial compartments, whereas its levels reduced significantly in endometriosis compared to the control group in the same menstrual cycle phase and tissue compartments. IL-10 mRNA levels were not detected in any endometrium. We detected the expression of all NKG2DL studied both, at the mRNA and protein levels, in epithelial cells isolated from the endometrium of both groups However, the transcripts and protein levels of these ligands were decreased in endometriosis compared to the control group. The presence of estradiol and/or prostaglandin did not affect the level of mRNA of any ligand studied. In summary, we have characterized, for the first time, the expression of the NKG2DL MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 and ULBP-3 in normal and pathological endometrium during the menstrual cycle. The sustained increase in MICA and ULBP-2 expression towards the late secretory phase suggests a greater activation of NK cells in the healthy premenstrual tissue, which coincides with a reduced expression of MICB in endometriosis. On the other hand, the differential expression of ULBP-3 and IL-12 observed in the secretory endometrium of women with endometriosis, in addition to the sharp decline in IL-10 expression observed in the late secretory phase in these patients, may favor the ectopic implantation of endometrial debris that reach the pelvic cavity. These results suggest that NKG2D receptor ligands, mainly MICA and ULBP-2, as well as IL-10 and IL-12 play an important role in the final stages of the menstrual cycle, during which the endometrium undergoes extensive remodeling preparing for embryo implantation or otherwise for disposal through menstruation. The results obtained herein in relation to the endometrium of women with endometriosis may partially explain infertility, as well as the ability of the menstrual tissue to escape immune surveillance, as described in these patients.