Evaluación de la interacción y co-tráfico de los canales TRPC3 y TRPM4

Abstract

Los canales de la superfamilia TRP son canales catiónicos no selectivos que permean principalmente Ca2+ y Na+, y comparten una arquitectura molecular general. Las subunidades de un canal TRP ensamblan en homo o heterotrámeros entre miembros de una misma o una diferente subfamilia compartiendo mecanismos de regulación y tráfico, lo que resulta en una gran diversidad de conductancias cationicas, en términos de sus propiedades regulatorias y biofísicas, por lo que han sido descritos como sensores polimodales que responden a una gran variedad de estímulos intracelulares y externos, cumpliendo roles fisiológicos esenciales en las funciones sensoriales, homeostáticas e incluso diversas funciones motiles como la contracción muscular y la migración celular. TRPC3 es un miembro de la subfamilia TRPC que está involucrado en un amplio espectro de mecanismos de señalización de Ca2+, y presenta propiedades de activación y regulación únicas que le permiten el reconocimiento e integración de múltiples estímulos. Este canal se asocia con varias proteínas permitiendo la formación de canales catiónicos diferentes en diversos tipos de células, afectando su actividad y función, por lo que es considerado un sensor multifuncional y versátil de gran relevancia fisiológica y fisiopatológica. Se ha visto que TRPC3 interacciona físicamente con TRPM4 en sistemas de expresión heterólogos, un miembro de la subfamilia TRPM impermeable a calcio, pero activado por este catión, que está involucrado en diferentes procesos fisiológicos, y cuya ganancia de función está relacionada con gran variedad de eventos fisiopatológicos como cáncer, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. En nuestro laboratorio, se encontró que las proteínas End Binding (EBs) interaccionan con un motivo ‘SxIP’ ubicado en la región amino terminal de TRPM4, y que xiii esta interacción TRPM4-EB gobierna el tráfico anterógrado del canal y su actividad. De acuerdo a estos antecedentes, se propone validar la interacción física entre TRPC3 y TRPM4, y evaluar si es que comparten mecanismos de tráfico y exportación a la superficie celular. Para ello, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación y se evaluó el co-trafico de estos canales utilizando diferentes aproximaciones en modelos de expresión heteróloga que coexpresaban ambos canales. Se encontró que efectivamente TRPM4 interacciona con TRPC3, y además que la deleción del ‘motivo SWIP’ de TRPM4 afecta la localización y exportación de TRPC3 a la superficie celular. Debido a la creciente relevancia fisiológica de los eventos de heteroasociación y co-trafico relacionados a los canales TRP, estos datos sugieren que la interacción física entre estos miembros de diferentes sufamilias TRP involucra mecanismos de tráfico asociado a la interacción TRPM4-EBs y podría tener relevancia en tejidos que coexpresen ambos canales, como en tejido cardiovascular o neuronal.

TRP proteins are non-selective cationic channels that permeate mainly Ca2+ and Na+, and share a general molecular architecture. TRP channels subunits assemble as homo or heterotetramers between members of the same or different subfamily, sharing regulation and trafficking mechanisms which results in a great diversity of cationic conductances, in terms of their regulatory and biophysical properties, so they have been described as polymodal sensors that respond to a wide variety of intracellular and external stimuli, fulfilling essential physiological roles in sensory, homeostatic and even diverse motile functions such as muscle contraction and cell migration. TRPC3 is a member of the TRPC subfamily involved in a broad spectrum of Ca2+ signaling mechanisms, and has unique activation and regulation properties that allow recognition and integration of multiple stimuli. These channels are associated with several proteins that allow it to form different cation channels in different types of cells, affecting the activity and function of the channel, so it is considered a multifunctional and versatile sensor of great physiological and physiopathological relevance. TRPC3 physically interacts with TRPM4, a member of the TRPM subfamily impermeable by calcium, but activated by this cation, which is involved in different physiological processes, and whose gain of function is related to a great variety of pathophysiological events, such as cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases. In our laboratory, we found that End Binding proteins (EBs) interact with a 'SxIP' motif located in the amino terminal region of TRPM4, and this TRPM4-EB interaction governs the anterograde trafficking of the channel and its activity. Accordingly, we achieved to validate the physical interaction between TRPC3 and TRPM4, and to evaluate whether these channels share trafficking and exporting mechanisms to the cell surface. To do that, we performed immunoprecipitation assays and the co-trafficking assays in heterologous systems that coexpressed both channels. We found that TRPM4 interacts with TRPC3. Moreover, we observed that the deletion of the 'SWIP motif' of TRPM4 affects the localization and exporting of TRPC3 to the cell surface. Due to the increasing physiological relevance of hetero-association and co-trafficking events related to TRP channels, these data suggest that the physical interaction between these members of different TRP subfamilies involve trafficking mechanisms associated with TRPM4-EBs interaction. These data could have relevance in tissues that coexpress both channels, as in cardiovascular or neuronal tissues.