Participación de Panexina-1 en la regulación del funcionamiento de Cav1.1

Abstract

En el músculo esquelético, la función más estudiada del receptor de dihidropiridina o canal de calcio tipo L (Cav1.1), además de su función como canal de Ca+2 tipo L, ha sido el acoplamiento excitación-contracción (ECC). En los últimos años, se ha descrito una nueva función para el Cav1.1, relacionando su actividad al acoplamiento excitación-transcripción (ETC). En el ETC, el Cav1.1 es clave y participa regulando la activación del canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP desde el interior hacia el exterior de la célula. En fibras musculares, nuestro grupo ha descrito que este proceso de liberación de ATP por parte de Panx1 puede activarse mediante un estímulo eléctrico. Aún más importante, este es un proceso dependiente de la frecuencia de estimulación eléctrica y que, en conjunto a otros intermediarios, genera señales de Ca+2 intracelulares regulando la expresión génica asociada a la plasticidad muscular. El control que ejerce el Cav1.1 sobre la actividad del Panx1 luego de estímulos eléctricos a frecuencias permisivas, demuestra una influencia unidireccional desde Cav1.1 hacia Panx1. Por otro lado, estas proteínas se encuentran a menos de 40 nm de distancia y co-inmunoprecipitan. A pesar de estos hallazgos, la estrecha regulación funcional entre Cav1.1 y Panx1 permanece poco explorada. Se ha descrito que el Cav1.1 en su rol en el ECC, ejerce una regulación unidireccional o anterógrada, en la cual, frente a la depolarización de la membrana plasmática sufre un cambio conformacional que activa al Receptor de Rianodina tipo 1 (RyR1) permitiendo la salida de Ca+2 desde el retículo sarcoplasmático y la contracción muscular. Sin embargo, en las últimas décadas se ha mostrado que existe también una regulación retrógrada desde RyR1 hacia Cav1.1, en la cual el RyR1 puede influenciar las características biofísicas del Cav1.1, como ocurre en modelos de inhibición o ausencia de RyR1, donde se encuentran alteraciones en la corriente de Ca+2 tipo L y en el “movimiento de carga” del Cav1.1. En relación a estos antecedentes, nuestra hipótesis es que existe una regulación retrógrada de Panx1 hacia Cav1.1. En este trabajo, evaluamos la influencia de Panx1 en la función de Cav1.1. Para esto, desarrollamos un modelo de knockdown para Panx1, con la técnica del RNA interferente, mediante la electroporación de un plasmidio shPanx1 en el músculo Flexor Digitorum Brevis (FDB). Medimos la corriente de Ca+2 tipo L y el movimiento de carga en condiciones de “potencial de membrana controlado, en célula completa” (Whole cell Voltage-Clamp) en fibras musculares aisladas del FDB. Observamos una disminución significativa en la amplitud de la corriente de Ca+2 tipo L durante los pulsos de potencial a 0 mV (p=0,023) y 10 mV (p=0,018) en las células que expresaban el plasmidio shPanx1 versus el control. Para el movimiento de carga, observamos una diferencia significativa en el parámetro V0.5, una de las variables de la distribución de Boltzmann para 2 estados, que representa el potencial de membrana al cual se desplaza la mitad de la carga máxima, mostrando una disminución de este valor en las fibras shPanx1 vs el control (p=0,047). De esta manera, podemos concluir que Panx1 cumple un rol en la regulación de la función de Cav1.1 por lo que la interacción funcional entre estas dos proteínas es bidireccional al igual que en el caso de Cav1.1 y RyR1. Esta interacción debe tenerse en cuenta en el desarrollo de futuros tratamientos farmacológicos que tengan como blanco a Panx1 y para condiciones patológicas donde la función de Cav1.1 se encuentre afectada, como la distrofia muscular, así como en aquellos procesos donde la adaptación muscular juega un rol vital, como son el envejecimiento y la diabetes.

In skeletal muscle, the most studied function of dihydropyridine receptor or L-type calcium channel (Cav1.1), in addition to its function as L-type Ca+2 channel, has been the excitation-contraction coupling (ECC). In recent years it has been described a new role for Cav1.1, linking their activity to the excitation-transcription coupling (ETC). In ETC, Cav1.1 is a key participant regulating the Pannexin 1 (Panx1) activation. This channel allows the outflow of ATP in a process dependent on the frequency of electrical stimulation and differents intermediaries, generates intracellular Ca+2 signals regulating gene expression associated with muscle plasticity. However, the close functional regulation between Cav1.1 and Panx1 remains little explored. In addition to this, for Cav1.1 in ECC, initially a unidirectional or anterograde regulation was described, in which Cav1.1 after cellular membrane depolarization undergoes a conformational change that activates ryanodine receptor type 1 (RyR1) allowing the Ca+2 release and muscle contraction. However, in recent decades a retrograde regulation from RyR1 to Cav1.1 has been described, evidenced as a change in the electrophysiology properties of Cav1.1 during blocking or absence of RyR1, with alterations in the L-type Ca+2 current and "Charge Movement", representatives of Cav1.1 function. Our hypothesis is that there is a retrograde regulation from Panx1 to Cav1.1. We evaluated the influence of Panx1 in Cav1.1 function. For this, we decreased the expression of Panx1 by electroporation of a shPanx1 plasmid, encoding an interference RNA against Panx1 in Flexor Digitorum Brevis (FDB). Then we measured the L-type Ca+2 current and the Charge Movement by the "whole cell control voltage" experiment (Voltage-Clamp) in isolated FDB muscle fibers. We observed a significant decrease in L-type Ca+2 current amplitude during the command pulses at 0 mV (p = 0.02297) and 10 mV (p = 0.01778) in shPanx1 vs control (mCherry). In Charge Movement we showed a significant difference in V0.5, a variable in two-state Boltzmann distribution, which represents the voltage at which there is a half maximum charge (Qmax) displacement, with a decrease in shPanx1 V0.5 vs control (p = 0.047). We can conclude that Panx1 has a role in the function of Cav1.1, so they have a bidirectional-relationship, the same that occurs between Cav1.1 and RyR1.