Rol de curcumina en la disminución de la transición epitelial-mesenquimal mediada por pirin en células de cáncer de cuello uterino

Abstract

El cáncer de cuello uterino (CCU) es un tipo de cáncer que tiene una etiología viral. Este agente es el virus papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR), el cual en un proceso tumoral sobreexpresa las oncoproteínas E6 y E7. Éstas últimas regulan la expresión de Pirin, que es una proteína que participa en la transición epitelial-mesenquimal (TEM) y en la migración celular. Se ha reportado que la TEM y la migración celular disminuyen en presencia del compuesto natural curcumina. Por esta razón, se propuso que dicha disminución causada por curcumina ocurre a través de un mecanismo dependiente de Pirin. Para demostrar esto, se utilizó la línea celular SiHa de CCU, con 1-2 copias integradas de VPH16. Con los ensayos de viabilidad y citotoxicidad celular (MTS) a distintos tiempos y concentraciones de curcumina se determinó que la concentración a utilizar era de 20 μM por 72 horas. Este tiempo y concentración están en concordancia con datos previamente publicados. Se analizó la expresión génica y los niveles proteicos de algunos marcadores de la TEM, con las técnicas RT-qPCR y Western Blotting, respectivamente. Para ello, en células tratadas con curcumina se extrajo ARN total y proteínas, los cuales se cuantificaron para ser utilizados en dichas técnicas. Los resultados obtenidos sugieren una disminución de la transición epitelial-mesenquimal en la línea celular SiHa expuesta a curcumina. Esto se respalda en la disminución de los niveles proteicos de N-cadherina, Vimentina y Slug en presencia de este compuesto natural. Además, se observó que la expresión de PIR y los niveles de Pirin disminuyeron en las células SiHa, al ser expuestas a curcumina. Luego, para analizar como la TEM depende de Pirin, las células SiHa utilizadas fueron transfectadas transientemente con un ARN interferente pequeño (ARNip) para el knockdown de PIR. Se observó un aumento significativo de transcritos de E-cadherina y una disminución significativa de N-cadherina en presencia del interferente. Además, se evidenció una disminución similar en la combinación del interferente con curcumina. Finalmente, se realizó un ensayo fenotípico de migración celular observándose una disminución significativa en presencia de este compuesto natural. La conclusión de esta tesis es que la disminución de la TEM inducida por curcumina, en este modelo experimental, ocurre por un mecanismo dependiente de Pirin. Se requieren experimentos adicionales para confirmar dicho mecanismo. La proteína Pirin podría ser un importante blanco farmacológico en el tratamiento del cáncer de cuello uterino.

Cervical cancer (CCU) has a viral etiology and it is induced by high-risk human papilloma virus (HR-HPV) that in turn, overexpresses E6 and E7 oncoproteins. These viral proteins regulate the expression of Pirin, which is a protein that participates in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cell migration. It has been reported that EMT and cell migration decrease in the presence of the natural compound curcumin. For this reason, it was proposed in this thesis that such decrease is caused by curcumin through a Pirin-dependent mechanism. To demonstrate this statement, SiHa cell line derived from cervical cancer was used since it contains 1-2 integrated copies of HPV16. Viability and cytotoxicity cell tests (MTS) were used to determine curcumin dose and exposures times. Results indicated a significant decrease in EMT after exposure to 20 μM curcumin for 72 hours in SiHa cell line. This is supported by a decrease in the protein levels of N-cadherin, Vimentin and Slug in the presence of curcumin. Furthermore, it was observed that PIR expression and Pirin protein levels significantly decreased in SiHa cells when exposed to curcumin. Then, to analyze if EMT depends on Pirin, SiHa cells were transfected with a small interfering RNA (siRNA) for the silencing of PIR. It was observed a significant increase of E-cadherin transcripts and a significant decrease of N-cadherin proteins levels in the presence of the siRNA. In addition, a similar decrease in the combination of the interferer with curcumin was evidenced. Finally, a phenotypic assay of cell migration was performed observing a significant decrease in the presence of this natural compound. It can be concluded in this thesis that the reduction of curcumin-induced EMT in this experimental model, occurs in a Pirin-dependent manner. To confirm this mechanism, additional experiments are warranted. Pirin protein could be an important pharmacological target in the treatment of cervical cancer.