Efectos de diferentes medios de criopreservación sobre la viabilidad de las células adherentes de la fracción vascular estromal derivadas del tejido adiposo : |b ¿cuál es el mejor medio crioprotector?

Abstract

El tejido adiposo cumple distintas funciones tales como protección mecánica, reserva de energía, función endocrina, etc. Durante los últimos años se ha documentado su uso como fuente abundante y accesible de células estromales multipotenciales para medicina regenerativa. Actualmente, el protocolo estandarizado comprende el procesamiento del tejido adiposo con una digestión enzimática (colagenasa) para posteriormente rescatar la fracción vascular estromal (SVF). Ésta se siembra en una matriz de plástico apta para cultivos celulares, obteniéndose un subgrupo de células elongadas que comienzan a adherirse a la placa de cultivo (SVF-AC), permitiendo la aparición de una población celular adherente denominada “células estromales derivadas del tejido adiposo”. Diversos estudios han demostrado que éstas mantienen su capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares (endo, meso y ectodérmico), siendo candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Sin embargo, una de las limitantes para la aplicación clínica de estas células, es contar con una masa celular critica que permita un adecuado tratamiento. Ante ello, surge la interrogante de cómo criopreservarlas, manteniendo a su vez, la viabilidad y el potencial de diferenciación luego de un ciclo de congelación. El uso de compuestos que tengan propiedades criopreservantes ha mostrado ser un prerrequisito para el éxito de un proceso de congelación. Idealmente, un medio para criopreservar SVF-AC debe tener una baja toxicidad y lograr una alta viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. En nuestro laboratorio, luego de criopreservar SVF-AC utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) 10%, no logramos obtener tasas de viabilidad descritas en la literatura. Nuestra hipótesis es que una combinación de un medio basal (medio DMEM/F12 con rojo fenol) suplementado con DMSO, trehalosa y albúmina humana puede mejorar significativamente las tasas de recuperación celular post criopreservación, en comparación con medios que utilizan sólo DMSO. En el presente trabajo, medimos la tasa de viabilidad celular post criopreservación de SVF-AC obtenidas de 5 pacientes utilizando medios definidos y libres de suero bovino: DMSO 10%; DMSO 10% + Trehalosa 7,6%; DMSO 10% + Albúmina humana 10% y DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10%; mediante ensayo metabólico midiendo absorbancia (MTT) e indeminidad de membranas cuantificado por citometría de flujo con ioduro de propidio (PI). Los resultados obtenidos nos demuestran que no existen diferencias estadísticamente significativas en las tasas de viabilidad de SVF-AC posterior a un ciclo de criopreservación a diferentes niveles, desde el punto de vista metabólico con el ensayo de MTT, y a nivel de estructura de membrana por marcación de PI por citometría de flujo. Sin embargo, se observa una tendencia a mejorar la tasa de recuperación de células vitales al agregar albúmina humana. Por otro lado no se lograron obtener tasas de viabilidad tan altas como las reportadas por otros autores. Se discuten las posibles causas y se proponen alternativas para estudiarlas. En conclusión, podemos decir que no existe ninguna condición estudiada que sea superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como en respuesta a la hipótesis de trabajo podemos afirmar que la criopreservación de las SVF-AC en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% + Trehalosa 7,6% + Albúmina humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente mayor que aquellas congeladas sólo con DMSO 10%.

Adipose tissue has different functions such as mechanical protection, energy reserve, endocrine function, etc. In recent years has been documented it use as abundant and accessible source of multipotent stromal cells for regenerative medicine. Currently, a standardized protocol comprises processing adipose tissue with enzymatic digestion (collagenase) and then rescue the stromal vascular fraction (SVF). This is sown in a plastic matrix suitable for cell cultures to yield a subset of elongated cells to adhere to the culture plate (SVF-AC), allowing the appearance of an adherent cell population called "stromal cells derived from adipose tissue". Several studies have shown that they maintain their ability to differentiate into multiple cell types (endo, meso and ectodermal), being suitable candidates for many applications in regenerative medicine and tissue engineering. However, one of the limitations for the clinical application of these cells is to have a critical cell number to provide an adequate treatment. In response, the question is how to cryopreservate them, while maintaining the viability and differentiation potential after a freeze cycle. Use of compounds with cryoprotective properties have shown to be a prerequisite for the success of a freezing process. Ideally, a cryoprotectant for SVF-AC must have low toxicity and achieve high cell viability without decreasing the differentiation potential. In our laboratory, after SVF-AC cryopreservation using 10% dimethyl-sulfoxide (DMSO) it is unable for us to obtain the viability rates reported in the literature. Our hypothesis is that a combination of a basal medium (DMEM / F12 medium with phenol red) supplemented with DMSO, trehalose and human albumin, can significantly improve cell recovery rates after cryopreservation compared to using only DMSO. In this study, we measured the rate of cell viability after cryopreservation of SVF-AC obtained from 5 patients using a defined and serum-free medium: 10% DMSO; 10% DMSO + 7.6% Trehalose; 10% DMSO + 10% human albumin and 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin; by measuring absorbance with a metabolic assay (MTT) and membrane indemnity quantified by flow cytometry with propidium iodide (PI). The results show us that there are no statistically significant differences in rates of SVF-AC viability after a cryopreservation cycle at different levels, from a metabolic point of view with the MTT assay, and membrane structure level with IP by flow cytometry. However, a tendency is observed to improve the recovery rate of vital cells by adding human albumin. On the other hand we could not get viability rates as high as those reported by other authors. Possible causes are discussed and proposed alternatives for study. In conclusion, we can say that there were not a studied condition better than others in terms of efficiency. Thus, in response to the working hypothesis we can say that the cryopreservation of the SVF-AC in a medium that combines DMEM / F12 with 10% DMSO + 7.6% Trehalose + 10% human albumin fails in obtaining a significantly higher recovery rate of vital cells than those frozen with only 10% DMSO.