Implementación de CRISPR-Cas9 para el desarrollo de virus herpes simple de tipo 2 mutantes con expresión interrumpida de las proteínas virales gG (US4), gD (US6) y gK (UL53)

Abstract

Diversos mecanismos de edición génica se han implementado a lo largo de los años para mutar el genoma del virus herpes simple tipo 2 (VHS-2). Éstos se han basado principalmente en el uso de procesos de recombinación homóloga. Un mecanismo comúnmente utilizado consiste en la realización de recombinación homóloga con un sustrato de intercambio alélico (AES) directamente sobre células transfectadas con genoma viral. Otra aproximación comúnmente utilizada es el desarrollo de recombinación homóloga en bacterias transformadas con un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene el genoma completo del virus herpes simple. La progenie viral mutante es luego obtenida mediante transfección de células con este material genético modificado. Si bien se han desarrollado diversas cepas mutantes de VHS-2 utilizando estas metodologías, ambas metodologías son laboriosas y presentan problemas técnicos tanto previos como posteriores a la generación de la mutación en el genoma. Dadas estas dificultades, se ha buscado desarrollar otros mecanismos más convenientes los cuales faciliten este proceso. Una metodología relativamente reciente que permite realizar modificaciones genéticas de manera más simple es aquella conocida como la tecnología de CRISPR-Cas9. Dada la mayor facilidad y especificidad de esta técnica, comparada a las más antiguas, nos propusimos mutar mediante el sistema CRISPR-Cas9, los genes virales US6, US4 y UL53 del VHS-2 para interrumpir la síntesis de las proteínas virales gD, gG y gK, respectivamente. Si bien se lograron desarrrollar los reactivos para realizar estas mutaciones, lamentablemente no se obtuvieron los aislados mutantes deseados. Se discuten los eventuales problemas que no permitieron lograr el objetivo

Several mechanisms of genetic edition have been implemented over the year to mutate the genome of herpes simplex virus type 2 (HSV-2). These have been based mainly on homologous recombination process. A mechanism commonly used consist in homologous recombination with an allelic exchange substrate (AES) directly on transfected cells with HSV genome. Another approach normally used is the development of homologous recombination in bacteria transformed with a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) that contains the complete genome of HSV. The mutant viral progeny is then obtained by transfecting cells with this modified genetic material. Even though several mutant strains of HSV-2 have been developed with these methodologies, both are laborious and present technical problems before and after the generation of the genome mutation. Due to this difficulties, it has been sought to develop other more convenient mechanisms to facilitate this process. A relatively recent methodology that allows genetic modifications to be made in a simpler way is that known as CRISPR/Cas9 technology. Due to the greater facility and specificity of this technique, compare to the other ones, we decided to mutate with CRISPR/Cas9 system, the viral genes US6, US4 y UL53 of HSV-2 to interrupt the synthesis of gD, gG and gK proteins, respectively. Even though we were able to develop the reagent to generate these mutations, unfortunately the desires viral mutant isolates were not obtained. In this we discuss the possible problems that not allow to achieve the desire objective.