Aproximación a la validación de método bioinformático de termoestabilización, basado en la enzima exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium, mediante reemplazo de aminoácidos por cisteínas en su dominio catalítico y su expresión en Pichia pastoris.

Abstract

Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa, ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria, cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de detergentes, papelera, y de biocombustibles. En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4 glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura, el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa. En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P. pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k. La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad asociada a ellas.

At present, the use of cellulose degrading enzymes, due to their degrading cellulose capacity, has hugely grown and has been reported in many industries including food and animal feed, brewering and wine production, textile, lanundry and detergents industries and also in pulp and paper, and biofuel production. In wildlife, cellulases are synthesized by fungi, bacteria, and are mostly secreted into the extracelular medium. These enzymes are a family composed of at least three groups: Endo-β-1,4-glucanases (EG), Exo-cellobiohydrolases (CBH) and β-glucosidases (BG), where all together are part of a catalytic complex acting synergistically, accompanied by other enzymes, degrading biomass. Due to the requirement of degrading cellulose by several industries and against the conditions this process is carried out, like the high temperatures needed, the design of new enzymes modifying sequences of mesophilic existing proteins, suggests to be a good option. In a previous work, in order to generate a predictive bioinformatic method for protein thermostabilization, the temperature effect over the structure of the ExoCellobiohydrolase I protein, Cel7C, from the fungus Phanerochaete chrysosporium, was studied using molecular dynamic methods. Based on it, three disulfide bonds introduction were proposed, each for a single variant enzyme, which must increase the structure rigidity at high temperatures, and therefore, their thermostability. To experimentally corroborate the bioinformatic prediction method proposed before, in this study, one of the three disulfide bonds was implemented for Cel7CDC. For this, two site directed mutations were made by PCR with primers that had the modification inside, to generate punctual mutations into the gene sequence. Two aminoacids were replaced by Cysteines into the protein chain: 325 Phenylalanine and 379 Glycine. The different variants of the gene were cloned into the pBluescript II SK (+) and were perpetuated into E. coli TOP10 cells, and also in pPIC9k vector, for the expression in P. pastoris KM71. The transformation was made and the selection of P. pastoris variants was carried out by prototrophy in lack of histidine, and then with growing concentrations of G418, as it is mentioned in the pPIC9k vector expression protocol. The selection was verified by colony PCR and DNA sequencing. The proteins expression was carried out by multi-copy Pichiia expression manual with the vector, and and after being analyzed through activity assays and zimograms, there was no associated activity found