Professor Advisor | dc.contributor.advisor | Lienqueo Contreras, María Elena | |
Author | dc.contributor.author | Aranda Soto, Natalia Beatriz | |
Associate professor | dc.contributor.other | Stange Klein, Claudia | |
Admission date | dc.date.accessioned | 2019-10-10T15:31:39Z | |
Available date | dc.date.available | 2019-10-10T15:31:39Z | |
Publication date | dc.date.issued | 2019 | |
Identifier | dc.identifier.uri | https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/171111 | |
General note | dc.description | Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. | es_ES |
Abstract | dc.description.abstract | Actualmente, el uso de enzimas celulasas, debido a su capacidad de degradar celulosa,
ha crecido enormemente y ha sido reportado en industrias como la alimentaria,
cervecera y vitivinícola, en la industria alimentaria animal, industrias textil y de
detergentes, papelera, y de biocombustibles.
En la naturaleza estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, y son
principalmente secretadas al medio extracelular. Estas enzimas pertenecen a una familia
compuesta de al menos tres grupos: exo-celobiohidrolasas (CBH), endo-β-1,4
glucanasa (EG) y β-glucosidasa (BG), las cuales forman parte de un complejo catalítico
que actúa de manera sinérgica, en compañía de otras enzimas, degradadando la
biomasa. Debido al requerimiento de degradar celulosa por parte de diferentes industrias
y ante las condiciones en las cuales se realiza este proceso, como la alta temperatura,
el diseño de nuevas enzimas, realizando modificaciones sobre secuencias de proteínas
mesófilas ya existentes sugiere ser una buena alternativa.
En un estudio anterior, con el fin de generar un método bioinformático predictivo para
termoestabilización de proteínas, se analizó el efecto de la temperatura sobre la
estructura de la exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium
usando métodos de dinámica molecular. Como resultado de esto se propuso la
introducción de tres puentes disúlfuro, cada uno para una proteína Cel7CDC mutante
diferente, los que deberían aumentar la rigidez de la estructura a altas temperaturas, y
por lo tanto, su termoestabilidad. Con el objetivo de corroborar experimentalmente el método de predicción bioinformática
utilizado, en este trabajo se implementó uno de los tres puentes disúlfuros propuestos
para Cel7CDC. Para esto se realizó mutación sitio dirigida mediante la técnica de PCR
con partidores que contenían la mutación en su interior, con objeto de generar dos
mutaciones puntuales en el gen codificante. Con esto se reemplazó la fenilalanina 325 y
la glicina 379 de la cadena aminoacídica de la proteína madura, por cisteínas. Las
variantes del gen generadas fueron clonadas en los vectores pBluescript II SK (+) y
fueron perpetuadas en E. coli TOP10, y también en el vector pPIC9k para ser expresadas
en P. pastoris KM71. Se realizó la transformación y la selección de las variantes de P.
pastoris se llevó a cabo por prototrofía en ausencia de histidina y luego con
concentraciones crecientes de G418 según protocolos de selección del vector pPIC9k.
La selección fue verificada mediante PCR de colonias y secuenciación. La expresión se
llevó a cabo según el manual de expresión en P. pastoris con el vector, y tras ser
analizadas mediante ensayos de actividad y zimogramas, no se encontró actividad
asociada a ellas. | es_ES |
Abstract | dc.description.abstract | At present, the use of cellulose degrading enzymes, due to their degrading cellulose
capacity, has hugely grown and has been reported in many industries including food and
animal feed, brewering and wine production, textile, lanundry and detergents industries
and also in pulp and paper, and biofuel production.
In wildlife, cellulases are synthesized by fungi, bacteria, and are mostly secreted into the
extracelular medium. These enzymes are a family composed of at least three groups:
Endo-β-1,4-glucanases (EG), Exo-cellobiohydrolases (CBH) and β-glucosidases (BG),
where all together are part of a catalytic complex acting synergistically, accompanied by
other enzymes, degrading biomass. Due to the requirement of degrading cellulose by
several industries and against the conditions this process is carried out, like the high
temperatures needed, the design of new enzymes modifying sequences of mesophilic
existing proteins, suggests to be a good option.
In a previous work, in order to generate a predictive bioinformatic method for protein
thermostabilization, the temperature effect over the structure of the ExoCellobiohydrolase I protein, Cel7C, from the fungus Phanerochaete chrysosporium, was
studied using molecular dynamic methods. Based on it, three disulfide bonds introduction
were proposed, each for a single variant enzyme, which must increase the structure
rigidity at high temperatures, and therefore, their thermostability.
To experimentally corroborate the bioinformatic prediction method proposed before, in
this study, one of the three disulfide bonds was implemented for Cel7CDC. For this, two
site directed mutations were made by PCR with primers that had the modification inside,
to generate punctual mutations into the gene sequence. Two aminoacids were replaced
by Cysteines into the protein chain: 325 Phenylalanine and 379 Glycine. The different
variants of the gene were cloned into the pBluescript II SK (+) and were perpetuated into
E. coli TOP10 cells, and also in pPIC9k vector, for the expression in P. pastoris KM71.
The transformation was made and the selection of P. pastoris variants was carried out
by prototrophy in lack of histidine, and then with growing concentrations of G418, as it is
mentioned in the pPIC9k vector expression protocol. The selection was verified by colony
PCR and DNA sequencing. The proteins expression was carried out by multi-copy Pichiia
expression manual with the vector, and and after being analyzed through activity assays
and zimograms, there was no associated activity found | en |
Lenguage | dc.language.iso | es | es_ES |
Publisher | dc.publisher | Universidad de Chile | es_ES |
Type of license | dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile | * |
Link to License | dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ | * |
Keywords | dc.subject | Enzimas celulasas | es_ES |
Keywords | dc.subject | Celulosa | es_ES |
Keywords | dc.subject | Phanerochaete chrysosporium | es_ES |
Keywords | dc.subject | Hongos | es_ES |
Título | dc.title | Aproximación a la validación de método bioinformático de termoestabilización, basado en la enzima exo-celobiohidrolasa I Cel7C del hongo Phanerochaete chrysosporium, mediante reemplazo de aminoácidos por cisteínas en su dominio catalítico y su expresión en Pichia pastoris. | es_ES |
Document type | dc.type | Tesis | |
Cataloguer | uchile.catalogador | lls | es_ES |
Department | uchile.departamento | Escuela de Pregrado | es_ES |
Faculty | uchile.facultad | Facultad de Ciencias | es_ES |