Cultivo en suspensión de células mesenquimales obtenidas de tejido adiposo para terapia celular

Abstract

La terapia celular ha sido presentada en los últimos años como una vía prometedora para tratar varias enfermedades. En este contexto, las células madre parecen ser la población ideal, debido a su capacidad de autorenovación y diferenciación a múltiples tipos celulares. La grasa, es uno de los tejidos más abundantes del ser humano, contiene una cantidad significativas de células madre y es fácilmente accesible mediante lipoaspirado. Tradicionalmente, las células madre derivadas de tejido adiposo (hASC) proliferan y se diferencian mediante técnicas de cultivo adherente, por lo que el escalamiento se basa en aumentar la superficie de crecimiento o el número de placas de cultivo. Sin embargo, estos métodos son laboriosos, costosos y susceptibles a la contaminación. Por otro lado, el cultivo en 3 dimensiones ofrece una opción fácilmente escalable, con la que se puede generar grandes cantidades de células en poco tiempo, pero aún no existe un protocolo establecido para llevar estas células a suspensión. El objetivo general es encontrar una metodología para adaptar las células hASC al crecimiento en suspensión y así diseñar una estrategia de escalamiento para el cultivo, manteniendo el potencial de diferenciación y las características fenotípicas de las células madre. Para estos, las células se caracterizaron en cuanto a su crecimiento y estado metabólico, para luego testear 5 medios de cultivo, variando el medio basal, la concentración de glucosa y la disponibilidad antioxidantes. El medio de cultivo con mejor desempeño, se utilizó para llevar las células a suspensión. Adicionalmente, se probaron alternativas xeno-free al suero fetal bovino, medios libre de calcio y tolerancia a surfactantes. Para el cultivo 3D, se evaluó el potencial de crecimiento en esferoides y en dos tipos de microcarrier comerciales, SoloHill y Cytodex 3. El cultivo resultante fue evaluado para verificar las características fenotípicas y la capacidad de diferenciación. Los mejores parámetros en cultivo adherente fueron logrados con el medio a-MEM con antioxidantes; se alcanzó una concentración máxima 0,38 · 10^6 [cel/ml], un tiempo de duplicación de 23 horas y un ∆L/∆G = 1,21. Al llevar las células a suspensión, estas no fueron capaces de proliferar en esferoides, pero si en microcarriers lo que indica que son dependientes de anclaje. El cultivo en Cytodex 3 logró una biomasa total de 0,37 · 10^6 [cel/ml], un 50 % más que el cultivo en SoloHill. Sin embargo, en ambos casos los parámetros de crecimiento no se mantuvieron respecto al cultivo adherente. Las células cosechadas, conservaron sus propiedades adherentes, los marcadores fenotípicos y su capacidad de diferenciación. El lisado de plaquetas humano demostró ser una alternativa xeno-free al suero bovino fetal, pero se debe estudiar su comportamiento en el cultivos en suspensión. Este estudio permitió establecer un medio de cultivo adecuado para la proliferación de las células hASC, mejorando significativamente los parámetros de cultivo. Además, se adaptó su crecimiento a suspensión mediante el uso de microcarriers, de manera que se tiene un sistema escalable y que podría proporcionar suficientes células para terapia celular.