Rol de EGFR en la activación del promotor P97 de HPV-16 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino expuestas a condensado de humo de cigarrillo

Abstract

La infección por el virus papiloma humano de alto riesgo (HR-HPV) ha sido reconocido como un factor etiológico para el desarrollo del cáncer cérvico uterino, aunque, en la mayoría de los casos la infección es benigna y no se traduce en enfermedad. Se ha sugerido que se requieren condiciones adicionales para la carcinogénesis. Estudios epidemiológicos han revelado que el tabaquismo es un cofactor para el inicio y la progresión del cáncer cérvico uterino, además, estudios in vitro han demostrado que algunos componentes del tabaco como Benzo[a]pireno, aumentan el titulo viral y la expresión de genes virales. No obstante, los mecanismos por los cuales el humo del tabaco coopera con HPV en el cáncer de cuello uterino son aún poco conocidos. Las líneas celulares derivadas del cáncer de cuello uterino CaSki y SiHa, se expusieron agudamente a condensado de humo de cigarrillo (CSC) en diversas concentraciones no tóxicas. Los resultados mostraron que la expresión de E6 y E7 se regula de forma dependiente de la dosis de CSC. Posteriormente, utilizando un vector reportero que contiene el exón de luciferasa bajo el control de la región larga de control (LCR) de HPV16, se confirmó la dependencia de la actividad del promotor p97 con el CSC. Además, mutaciones puntuales en los elementos de respuesta a TPA residentes en la LCR (sitios TRE) disminuyeron significativamente la activación del promotor p97. Ensayos fosfoproteómicos y el uso de inhibidores específicos revelaron que la sobreexpresión de E6 / E7 mediada por CSC es, al menos en parte, dependiente de la fosforilación de EGFR. Además, se demostró que la vía PI3K/Akt es crucial para la sobreexpresión de E6/E7 inducida por CSC. Finalmente, se observó que la sobreexpresión de E6/E7 de HPV16 está mediada por la sobreexpresión de c-jun, la fosforilación de c-Jun y el reclutamiento de este factor de transcripción para los sitios TRE en la LCR de HPV16. Los resultados expuestos permiten concluir que la exposición aguda a condensado de humo de cigarrillo activa la transcripción de los oncogenes E6 y E7 de HPV16 a través de la activación del promotor p97, lo cual implica activación de la vía de señalización EGFR / PI3K / AKT / C-jun en células de cáncer de cuello uterino.

High-risk human papillomavirus (HR-HPV) infection is not a sufficient condition for cancer development because most infections are benign and naturally cleared. Previous reports suggest that tobacco smoke stimulates viral genes transcription in cervical cancer cells and epidemiological studies have revealed that tobacco smoking is a cofactor with HR-HPV for cervical cancer initiation and progression. On the other hand, previously we demonstrated that cigarette smoke condensate (CSC) can activate the HPV16 p97 promoter activity. However, the mechanisms by which tobacco smoke cooperates with HR-HPV in cervical cancer are poorly understood. Therefore, the aim in this thesis is to characterize the role of some signaling pathways involved in the CSC-mediated HPV-16 p97 promoter activation Cervical cancer-derived cell lines, CaSki (HPV16; 500 copies per cell) and SiHa (HPV16; 2 copies per cell), were acutely exposed to cigarette smoke condensate (CSC) at various non-toxic concentrations. Consistent with many previous reports, E6 and E7 expression was significantly upregulated in a dose-dependent manner in the presence of CSC. Using a reporter construct containing the luciferase gene under the control of the full HPV16 long control region (LCR), we confirmed the CSC-dependence of p97 promoter activity. Mutations in the LCR-resident TPA-response elements (TRE sites) significantly decreased p97 promoter activation. Using phosphoproteomic arrays and specific inhibitors it was revealed that CSC-mediated E6/E7 overexpression is at least in part reliant on EGFR phosphorylation. On the other hand, EGFR phosphorylation was necessary for CSC-mediated E6/E7 overexpression. In addition, we showed that the PI3K/AKT pathway is crucial for CSC-induced E6/E7 overexpression. Finally, we demonstrated that HPV16 E6/E7 overexpression is mediated by c-jun overexpression, c-Jun phosphorylation and recruitment of this transcription factor to TRE sites in the HPV16 LCR. We conclude that acute exposure to tobacco smoke activates the transcription of HPV16 E6 and E7 oncogenes through p97 promoter activation, which involves the EGFR/PI3K/AKT/C-jun signaling pathway activation in cervical cancer cells lines.