Selección de líneas transgénicas de Actinidia deliciosa (kiwi) que expresan el gen DcAREB3 y estudio preliminar de la tolerancia a estrés salino

Abstract

Actinidia deliciosa corresponde a una fruta de relevancia económica para Chile y se ha descrito como altamente sensible a la salinidad del suelo, en donde concentraciones cercanas a los 50 mM NaCl requieren que se aplique un fuerte manejo agronómico para mantener su producción. Los factores de transcripción de tipo AREB/ABF o proteínas de respuesta a Acido Abscísico (ABA) descritos en Arabidopsis thaliana son factores del tipo bZIP que participan en la respuesta mediada por la hormona vegetal ABA, que modera la tolerancia de plantas a altas concentraciones de sal, frío o sequía. La síntesis de ABA comienza con la de sus precursores carotenoides gracias a la enzima PSY. En Daucus carota, nuestro modelo de estudio, existen dos copias de PSY que presentan tres secuencias de unión para factores AREB/ABF en su promotor. Luego de un estudio de alineación para factores de transcripción de tipo AREB/ABF entre D. carota y A. thaliana, se obtuvieron tres factores DcAREB que fueron caracterizados, dentro de los cuales destaca DcAREB3, objeto de estudio en este seminario de título. DcAREB3 fue previamente transformado en A. deliciosa para dilucidar si el gen DcAREB3 otorga o no protección frente a estrés abiótico y en este trabajo genotipificamos las líneas transgénicas y el nivel de expresión relativo del gen DcAREB3 en ellas, para luego realizar un ensayo de tolerancia a estrés salino en plantas transgénicas. Para llevar a cabo los objetivos, se mantuvieron y propagaron in vitro las plantas transgénicas, así como sus respectivos controles. Mediante PCR se obtuvieron 7 líneas transgénicas para DcAREB3, de las cuales la línea 1y 6 tenían el mayor nivel de expresión relativo del transgén y las líneas 4 y 7 no presentaron abundancia de transcrito. Finalmente, se realizó un ensayo DAB semicuantitativo para medir los niveles de peróxido de hidrógeno en hojas de A. deliciosa frente a estrés salino. Debido a la falta de tejido vegetal, el ensayo de tolerancia a estrés salino se realizó con un pool general de hojas de las líneas transgénicas y solo se obtuvo un resultado preliminar, el cual indica que el gen DcAREB3 no protegería a las plantas transgénicas frente a estrés salino. Sin embargo, para tener conclusiones más confiables se debería repetir el experimento con plantas completas o con un número mayor de hojas por línea transgénica y al menos dos repeticiones por condición.

Actinidia deliciosa is a fruit of economic relevance for Chile and has been described as highly sensitive to soil salinity, where it is specifically determined at 50 mM NaCl that a strong agronomic management is required to maintain its production. AREB/ABF-type transcription factors or Abscisic Acid (ABA) response proteins described in Arabidopsis thaliana are bZIP-type transcription factors that participate in the response mediated by ABA plant hormone, which moderates plant tolerance to high amounts of salinity, cold or drought. The synthesis of ABA begins with that of its carotenoid precursors thanks to the PSY enzyme. In Daucus carota, our study model, there are two copies of PSY that present three binding sequences for AREB/ABF factors in its promoter. After an alignment study for transcription factors of AREB/ABF type between D. carota and A. thaliana, we obtained three DcAREB factors that were characterized, among which DcAREB3 stands out, object of study in this title seminar. DcAREB3 was previously transformed into A. deliciosa to determine whether grants protection against salt stress and in this work, we genotyped the transgenic lines and the level of relative expression of the DcAREB3 gene and performed a salt stress tolerance test in transgenic plants. To achieve the objectives, the transgenic plants, as well as their controls, were maintained and propagated in vitro. By means of PCR, 7 transgenic lines were obtained for DcAREB3, of which line 1 and 6 had the highest level of relative expression of the transgene and line 4 and 7 did not. Finally, a semi-quantitative DAB test was performed to measure hydrogen peroxide levels in A. deliciosa leaves against saline stress. Due to the lack of sufficient plant tissue, the salt stress tolerance test was performed with a general pool of leaves of the transgenic lines and only a preliminary result was obtained, which indicates that the DcAREB3 gene does not protect the transgenic plants against saline stress. However, to have more reliable conclusions, the experiment should be repeated with whole plants or with a greater number of leaves per transgenic line and at least two repetitions per condition.