Interactómica de JMJD1B en extractos citosólicos de células HeLa y su rol en la maduración citosólica de las histonas H3 y H4

Abstract

Las histonas, proteínas conocidas por compactar el ADN y formar la cromatina en células eucariontes, tienen además la función de regular procesos de expresión génica, debido a que son susceptibles a modificaciones post-traduccionales (PTMs) que regulan el nivel de interacción con el ADN y el reclutamiento de otros factores. Sin embargo, antes de ingresar al núcleo, y después de su síntesis, las histonas H3 y H4 son procesadas a través de una cascada de maduración citosólica. Dentro de este contexto, existe una desmetilasa de histonas, JMJD1B, cuyo rol en el citoplasma todavía no está claro, pero se ha observado que está relacionado con mantener una población de histonas solubles en el citoplasma listas para ser depositadas en la cromatina, y relacionado también con controlar los niveles citosólicos de una chaperona de histonas denominada tNASP. El knockdown de esta desmetilasa provoca la acumulación de H3 y tNASP en el citosol, además, la sobreexpresión de tNASP recapitula el fenotipo de la pérdida de función de JMJD1B. Pese a que el sustrato de esta enzima en el citoplasma sigue siendo desconocido, nosotros postulamos que podría ser tNASP. Para dilucidar esto, en este trabajo investigamos la interactómica de JMJD1B y estudiamos si existe una interacción física entre JMJD1B y tNASP. Mediante ensayos de pull down analizados por western blot, comprobamos que JMJD1B interactúa con H3 y también encontramos una interacción con actina, pero no con tNASP. Mediante ensayos de pull down utilizando marcaje SILAC, analizados por espectrometría de masas, identificamos 9 proteínas interactuantes de JMJD1B, entre las que se encuentran chaperonas de proteínas varias y también chaperonas de histonas.Futuros estudios debiesen enfocarse en investigar la interacción entre JMJD1B y Hsp90, debido a que esta última es una chaperona que estabiliza a tNASP y pudiese tener relación en controlar los niveles citosólicos de tNASP y en consecuencia de H3.

Histones are proteins known to compact DNA and participate in chromatin formation, but also, those proteins regulate gene expression processes because they are susceptible to post-translational modifications (PTMs) modifying the interaction with DNA and the recruitment of other factors. However, following their biosynthesis and before they go into the nucleus, histones H3 and H4 are processed through a cytosolic maturation cascade. In this context, the demethylase JMJD1B, whose cytoplasmic role is still unknown, maintains a soluble histone population in the cytoplasm for chromatin formation, and it also regulates the cytoplasmic levels of a chaperone called tNASP. The KD of this demethylase induces H3 and tNASP cytosolic accumulation. tNASP overexpression mimics the phenotype observed in the JMJD1B KD. Which are the substrates of this enzyme in cytoplasm is still unknown, we suggest that tNASP could be one of them. In this work we investigated the JMJD1B interactome to identify potential substrates related to the newly synthesized histone H3 and H4 maturation cascade, and also we studied a physical interaction between JMJD1B and tNASP. Using pull down assays followed by western blot analysis, we proved the interaction of JMJD1B with H3, and also found an interaction with actin, but not with tNASP. Using pull down assays coupled with SILAC labeling, followed by mass spectrometry analysis, we identified 9 proteins interacting with JMJD1B which included unspecific chaperones and histones chaperones. Future studies should focus on JMJD1B and Hsp90 interaction, because this last one is a chaperone that stabilizes tNASP and may be involved in maintaining cytosolic levels of tNASP and H3.