Identificación y análisis de enzimas comúnmente expresadas en levaduras antárticas

Abstract

Durante las últimas décadas se ha puesto atención en los microorganismos que habitan ecosistemas con temperaturas permanentes bajo los 5ºC, ya que surgen preguntas sobre cómo han evolucionado para adaptarse a estos hábitats, además de presentar un gran potencial para la industria biotecnológica. La evidencia indica que estos microorganismos presentan enzimas adaptadas al frío, las cuales han adquirido ciertas cualidades estructurales que les permiten realizar reacciones químicas a bajas temperaturas, sacrificando su termoestabilidad estructural. Sin embargo, existen casos donde estas modificaciones no están presentes, por lo que existe la duda de si son adaptaciones transversales a todos los microorganismos adaptados al frío o son especie dependientes. El objetivo principal de este trabajo es comparar y analizar enzimas expresadas en levaduras antárticas, las cuales fueron aisladas de la misma zona subantártica (Isla Rey Jorge) y presentan distintas temperaturas óptimas de crecimiento, por lo que son un buen modelo de estudio para determinar si las adaptaciones al frío son una característica transversal a estas levaduras o si varían dependiendo de la especie. Se comenzó analizando los transcriptomas ensamblados de las levaduras Cryptococcus sp., Mrakia gelida, Vishniacozyma victoriae, Phenoliferia glacialis, Tetracladium sp., Candida sake, Leucosporidium creatinivorum y Wickerhamomyces anomalus, obteniendo marcos de lectura abiertos, los cuales se identificaron por BLAST. Se encontraron nueve enzimas: alcohol deshidrogenasa, alfa-glucosidasa, betaglucosidasa, amilasa, isocitrato deshidrogenasa, celulasa, invertasa, proteinasa K y fosfatasa ácida. Se decidió seguir con la beta-glucosidasa y la alcohol deshidrogenasa debido a que se encontraban expresadas en las ocho levaduras, además de una glucoamilasa de la levadura Tetracladium sp. descrita en estudios anteriores. Utilizando el programa online Philius se buscaron péptidos señal, encontrando uno en el caso de la alcohol deshidrogenasa, uno en la beta-glucosidasa y uno en la glucoamilasa, los cuales fueron removidos. También se determinó la localización subcelular con el programa Euk-mPLoc 2.0 para cada enzima, siendo el citoplasma y la mitocondria para la alcohol deshidrogenasa, el citoplasma y espacio extracelular para la beta-glucosidasa y el espacio extracelular para la glucoamilasa. Por medio del programa PredyFlexy se obtuvo los residuos flexibles en la estructura de cada enzima y se tabularon. Utilizando el programa Swiss-model e I-TASSER se construyeron modelos tridimensionales de cada enzima para analizar el sitio activo en términos de su volumen por medio del programa UCSF Chimera. Para la alcohol deshidrogenasa se obtuvo un volumen del sitio activo de en promedio 346,15 Å! con Swiss-Model y 614,43 Å! con I-TASSER, respectivamente. En el caso de la beta-glucosidasa el volumen del sitio activo en promedio fue de 315,82 Å! con Swiss-Model y 406,25 Å! con I-TASSER, respectivamente. Para la glucoamilasa el volumen fue 323,87 Å! con Swiss-Model y 380,39 Å! con I-TASSER, respectivamente. Por último se envió a sintetizar las secuencias codificantes de cada enzima, donde se optimizó los codones para la posterior expresión en Pichia pastoris y se agregaron sitios de restricción a los extremos.

During the past few decades, there has been a high interest in microorganisms inhabiting ecosystems with constant temperatures below 5ºC, to know about their adaptation to these environments, and by their great biotechnological potential. The enzymes of these microorganisms have a set of structural adaptations that allows them to perform chemical reactions in low temperature environments, sacrificing their thermostability. However, there are not enough examples to assert these adaptations are found across all coldadapted microorganisms or if it is a species-dependent feature, besides, the majority of studies have been performed on bacterial enzymes. The main objective of this work is to compare and analyze commonly expressed enzymes from antarctic yeasts that were isolated from the same sub-antarctic region (King George Island), and show different optimal growth temperature, being a suitable model to determine if cold-adaptation features occur along every cold-adapted yeast or if it happens in a species-dependent manner. The transcriptomes of the yeasts species Cryptococcus sp., Mrakia gelida, Vishniacozyma victoriae, Phenoliferia glacialis, Tetracladium sp., Candida sake, Leucosporidium creatinivorum and Wickerhamomyces anomalus were analyzed, and the obtained open reading frames were identified using BLAST tool. Nine enzymes were found: alcohol dehydrogenase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, amylase, isocitrate dehydrogenase, cellulase, invertase, proteinase K and acid phosphatase. The alcohol dehydrogenase and beta-glucosidase were chosen for this work as they are expressed in all eight yeasts, along with a glucoamylase from Tetracladium sp. described in previous studies. Signal peptides were identified using the online software Phillius, finding one in the case of alcohol dehydrogenase, one in beta-glucosidase and one in glucoamylase, which were removed. The subcellular location of every sequence was determined using the online software Euk-mPLoc 2.0, being the cytoplasm and mitochondria the most common locations for the alcohol dehydrogenase, cytoplasm and extracellular space for the beta-glucosidase and the extracellular space for the glucoamylase. The flexible amino acids of each enzyme were determined by the online software PredyFlexy. 3D models of each enzyme were created using Swiss-Model and I-TASSER and the active site was analyzed in terms of its volume using the software UCSF Chimera. For the alcohol dehydrogenase, the mean volume of the active site using Swiss-Model was 346,15 Å!, while using I-TASSER was 614,43 Å!, respectively. For the beta-glucosidase, the mean volume of the active site using Swiss-Model was 315,82 Å!, while using I-TASSER was 406,25 Å!, respectively. For the glucoamylase, the volume of the active site using Swiss-Model was 323,87 Å!, while using I-TASSER was 380,39 Å!, respectively. Ultimately, the coding sequences were sent to GeneUniversal for synthesis, where codon optimization was performed for heterologous expression in the yeast Pichia pastoris and restriction sites were added on each end of every sequence.