Las células dendríticas renales son necesarias para el desarrollo de Hipertensión Arterial en respuesta a Angiotensina II

Abstract

Aumentos de Angiotensina II (AngII) plasmática causan Hipertensión Arterial (HTA), inflamación y daño de tejidos blanco. Estudios recientes indican que el sistema inmune participa en la generación del aumento de presión arterial (PA) en respuesta AngII. El suministro de fármacos inmunosupresores que disminuyen el número y actividad de linfocitos, o la ausencia genética de linfocitos T (LT), previenen parcialmente desarrollo de HTA en respuesta AngII. Además, el bloqueo de la interacción entre células presentadoras de antígenos profesionales que controlan la diferenciación de LT, células dendríticas (DCs), y LT previene parcialmente el desarrollo de HTA en respuesta a AngII. Estudios de nuestro laboratorio mostraron que la eliminación de DCs previene el desarrollo de HTA inducia por dieta rica en sal y la infusión de AngII. Todos estos antecedentes sugieren que las DCs son necesarias para el desarrollo de HTA en respuesta a AngII. Sin embargo, nuestros estudios previos no permitieron establecer si el requerimiento de las DCs es debido al rol de la ingesta de sal como agente proinflamatorio, o bien si la acción de AngII como inductor de HTA requiere de las DCs. Además, considerando que el riñón presenta una abundante población DCs intersticiales y que citoquinas producidas por DCs modulan la actividad de transportadores del túbulo renal, es posible que DCs renales modifiquen la excreción urinaria de sodio regulando la función de las células tubulares. En consecuencia, la hipótesis de la presente tesis propone que las DCs renales son necesarias para el desarrollo de HTA en respuesta a AngII. El objetivo general fue estudiar si la presencia/ausencia de DCs renales modifica el desarrollo de HTA, la reabsorción de sodio renal y/o la reactividad vascular en respuesta a Angiotensina II. Utilizamos ratones genotipo silvestre (WT) y genéticamente modificados (CD11c.DOG) que permiten la eliminación de DCs mediante la inyección de toxina diftérica (DT). Ambas cepas recibieron tres tipos de tratamiento (14 días; 6 grupos experimentales): Vehículo, AngII y AngII+DT. Realizamos estudios fisiológicos y moleculares en tejido cardiovascular y renal. Nuestros resultados muestran que la ablación de DCs en ratones CD11c.DOG previno el desarrollo de HTA en respuesta a la infusión de AngII. De acuerdo con los estudios fisiológicos, este efecto se asoció a la preservación de la capacidad natriurética, particularmente a la menor reabsorción de NaCl en la rama gruesa del Asa de Henle. Además, se asoció a disminución en la abundancia del cotransportador sodio-potasio-cloruro-2 (NKCC2) de la rama gruesa del Asa de Henle y a la prevención en la inducción de transportadores de sodio del nefrón distal observada en los grupos de animales que sólo recibieron AngII (cotransportador de sodio y cloruro, NCC; Canal Epitelial de Sodio, ENaC). No encontramos diferencias en la función vascular de animales AngII al comparar grupos con vs. sin DCs. Posteriormente, para evaluar si las DCs renales (rDCs) vs. DCs esplénicas modulan la PA, realizamos transferencia adoptiva de DCs provenientes de animales WT tratados con vehículo o AngII. Observamos que la transferencia de rDCs de animales tratados con AngII causó el aumento de la PA (102.6±2.9 (basal) hasta 123.3±4.4; P<0.001) 24h posterior a la transferencia, asociado a la disminución de la capacidad natriurética. El aumento de PA se mantuvo hasta el día 8. Estudios de marcaje de rDCs y seguimiento in vivo mostraron que las rDCs presentan destinación renal, independiente del tratamiento previo. Para probar si la acción inductora de aumento de la PA por rDCs de animales AngII requiere la presencia de LT realizamos la transferencia de rDCs AngII a ratones carentes de LT y LB (RAG1-/- ). Observamos que la transferencia de rDCs provenientes de animales tratados con AngII, no indujo un aumento en la PA en los animales receptores. Finalmente, realizamos un estudio detallado del fenotipo de las rDCs provenientes de animales tratados con AngII, utilizando citometría de flujo para la detección de un panel de marcadores para células mieloides del sistema monocito/macrofágico y marcadores de actividad/maduración. En comparación a las rDCs de animales que recibieron infusión de vehículo, las rDCs de animales AngII mostraron inducción de los marcadores CD80, CD86, MHC-II. Mediante estudios moleculares encontramos que las rDCs presentaron aumento de la abundancia de transcritos de citoquinas pro-inflamatorias (IL-6, IL-1β, IL-23 e γINF). El análisis del transcriptoma de las rDCs mostró cambios de abundancia de diversos transcritos con el tratamiento de AngII, que mediante análisis bioinformático pueden ser agrupados como moléculas pertenecientes a diversas funciones celulares. Estudios iniciales (RT-PCR cuantitativo en tiempo real) en un grupo seleccionado de transcritos para proteínas que modulan la función del túbulo renal confirmaron los resultados ómicos. Los resultados de esta tesis muestran que las DCs son necesarias para el aumento de la PA en respuesta a AngII. El aumento de AngII circulante produce un cambio fenotípico de las rDCs, que disminuyen la excreción urinaria de sodio. En el largo plazo, la acción inhibidora de la natriuresis de la AngII depende de las DCs, que son necesarias para que se modifiquen los niveles de expresión de transportadores de sodio de la membrana apical del túbulo renal. Este es el primer estudio que muestra que AngII, a través de la modulación del fenotipo de rDCs, modula la excreción urinaria de sodio y la PA.

High Angiotensin II (AngII) plasma levels cause Hypertension (HBP), inflammation and target tissues damage. Recent studies indicate that the immune system participates in the generation of increased blood pressure (BP) in response to AngII. The administration of immunosuppressive drugs that decrease the number and activity of lymphocytes, or the genetic absence of T lymphocytes (LT), partially prevented AHT development in AngII infused rodents. In addition, blocking the interaction between professional antigen presenting cells that can modulate LT differentiation, dendritic cells (DCs), and LT partially prevented the development of HBP in response to AngII. Studies from our laboratory showed that the ablation of DCs prevented the development of HBP caused by high salt diet and AngII infusion. All these data suggested that DCs are necessary for the development of HBP in response to AngII. However, our previous studies did not allow us to establish if the requirement of the DCs is due to the role of salt intake as a proinflammatory agent, or if the action of AngII as an inducer of HBP requires DCs. In addition, considering that the kidney has interstitial DCs in abundance and that cytokines produced by DCs can modulate the activity of renal tubule transporters, it is plausible that renal DCs modify the urinary sodium excretion by modulating the function of renal tubule cells. Consequently, the hypothesis of this thesis proposes that renal DCs are necessary for the development of hypertension in response to AngII. The general objective was to study whether the presence/absence of renal DCs modifies the development of hypertension, renal sodium reabsorption and/or vascular reactivity in response to Angiotensin II. We used genetically modified (CD11c.DOG) genotype mice that allow the ablation of DCs by diphtheria toxin (DT) injection and WT mice. Mice from both strains were allocated to one of three treatments (14 days, 6 experimental groups): Vehicle, AngII and AngII + DT. We performed physiological and molecular studies in cardiovascular and renal tissue. Our results showed that ablation of DCs in CD11c.DOG mice prevented the development of hypertension in response to AngII infusion. This effect was associated with the preservation of the natriuretic, particularly to a lower NaCl absorption in the thick ascending limb of the Henle’s loop. n addition, preserved natriuresis associated with lower abundance of the sodium potassium-chloride cotransporter-2 (NKCC2) from the thick ascending limb of the Henle’s loop and the prevention of the induction of distal nephron NaCl tramsporters that was observed in animals that received AngII only (sodium and chloride cotransporter, NCC; Sodium Epithelial Channel, ENaC). We did not find differences in vascular function of AngII animals when comparing groups with or without DCs. Subsequently, to evaluate whether renal DCs (rDCs) vs. Splenic DCs modulate BP, we performed adoptive transfer of DCs from WT animals treated with vehicle or AngII. We observed that rDCs transfer from AngII-treated animals increased BP (102.6 ± 2.9 (basal) to 123.3 ± 4.4, P <0.001) 24h after transfer, which was associated with lower natriuretic capacity. The increase in BP was maintained until day 8. Studies of rDCs labeling and in vivo follow-up showed that the rDCs present renal destination, independent of previous treatment. To test whether the increase in BP by rDCs from AngII mice required the presence of T cells, we transferred rDCs from AngII mice to mice lacking T and B cells (RAG1 -/- ). We observed that the transfer of rDCs from animals treated with AngII did not induce an increase in BP in the recipient animals. Finally, we conducted a detailed study of the phenotype of rDCs from animals treated with AngII, using flow cytometry with myeloid cells markers (monocyte/ macrophage system) and activity/maturation markers. Compared to the rDCs from mice that received vehicle infusion, the rDCs of AngII-mice showed higher levels of CD80, CD86 and MHC-II. The transcriptome analysis of the rDCs showed that the treatment with AngII modified the abundance of several transcripts, which can be grouped by bioinformatic analysis as molecules belonging to several cell functions. Initial studies (quantitative RT-PCR in real time) in a selected group of transcripts for proteins known to modulate renal tubule function confirmed the omic results. The first molecular studies showed that AngII-rDCs had an increased in the abundance of pro inflammatory cytokine transcripts (IL-6, IL-1β, IL-23 and γINF). The results of this thesis show that DCs are necessary for the increase of BP in response to AngII. The increase of circulating AngII produces a phenotypic change of the rDCs, which decrease the urinary sodium excretion. In the long term, the inhibitory action of AngII natriuresis depends on the DCs, which are necessary for modifying the expression levels of sodium transporters of the apical membrane of the renal tubule. This is the first study showing that AngII modulates the urinary excretion of sodium and PA through the modulation of the rDCs phenotype.