Estudio del rol de Pink1 en el olfato de pez cebra (Danio Rerio) a edades tempranas

Abstract

La enfermedad de Parkinson (EP) es principalmente conocida por su sintomatología motora, sin embargo, también presenta otro tipo de síntomas, conocidos comúnmente como síntomas no motores. Dentro de estos, las disfunciones olfatorias se manifiestan en un alto porcentaje de casos esporádicos de EP, apareciendo años antes de los síntomas motores. Aunque algunos estudios han relacionado las alteraciones olfatorias con mutaciones en el gen de PINK1, una quinasa mitocondrial asociada con Parkinsonismo juvenil de herencia recesiva, aún no se han comprendido a cabalidad las bases biológicas de este fenómeno. Este proyecto tuvo como objetivo el estudio de las alteraciones olfatorias tempranas en un modelo de pez cebra con pérdida de función de PINK1. Se ha observado que esta línea presenta una disminución significativa de las neuronas dopaminérgicas en el diencéfalo a los 5 dpf, lo que sugiere que las alteraciones olfatorias podrían manifestarse tempranamente. Para ello se realizaron test conductuales para detectar posibles alteraciones olfatorias, usando cisteína como odorante aversivo y alanina como odorante atractivo para el pez. Además se evaluó la morfología y neuroquímica del bulbo olfatorio en etapas tempranas, enfocado en las conexiones dopaminérgicas y serotoninérgicas por su relación con la función olfatoria. Conductualmente, se observaron diferencias asociadas con la edad en larvas WT y PINK1-/-, lo que puede relacionarse con la maduración del sistema olfatorio. La conducta basal en larvas PINK1-/- mostró signos de hiperactividad a los 3, 4 y 5 días post fertilización (dpf), recorriendo cerca del doble de la distancia en comparación con el control WT. Así mismo, la estimulación mecánica generada por aplicación de medio E3, indujo un aumento en la distancia recorrida por larvas PINK1-/- a los 3 y 4 dpf. Por otro lado, larvas PINK1-/- de 4 dpf expuestas a cisteína presentaron una respuesta mayor a la observada para larvas WT, con un aumento del nado a velocidades altas (>9 mm/s). Sin embargo, larvas PINK1-/- de 3 dpf expuestas a alanina, no mostraron el aumento de la distancia de nado ni de la velocidad media (3-9 mm/s) observada en WT. En su conjunto, estos resultados sugieren que la conducta observada responde a dos fenómenos: (i) existen alteraciones olfatorias tempranas que afectan la capacidad de las larvas PINK1-/- para percibir el estímulo, y (ii) un posible fenotipo ansioso en estas larvas, indicado por el incremento en la distancia y velocidad de nado ante un estímulo aversivo. El análisis morfológico y neuroquímico en larvas WT del bulbo olfatorio mostró que hay un aumento proporcional del volumen de las regiones dG-maG, lG-dlG y vmG-vaG-vpG entre los 3 y 5 dpf. Además, se observó un aumento en el largo y distribución de la inervación 5HT(+) y en el número de neuronas TH(+) en el bulbo, lo que sugiere una mayor participación de los sistemas reguladores de la actividad sináptica en la capa glomerular. Estos resultados indican que las larvas PINK1-/- manifiestan fenotipos no motores tempranos. Por un lado, la pérdida olfatoria y la ansiedad, dos síntomas tempranos que se correlacionan en los enfermos de Parkinson. Por otro, la hiperactividad de las larvas, lo que puede reflejar un posible efecto compensatorio del sistema antes de que los síntomas motores se manifiesten. Aunque es necesario confirmar estas observaciones mediante estudios de la actividad sináptica en el bulbo olfatorio y análisis conductuales específicos para la ansiedad, este trabajo de tesis valida la línea PINK1-/ de pez cebra como un excelente modelo para la investigación en etapas iniciales de la EP.

Parkinson’s disease (PD) is mainly known for its motor symptoms, however, it also presents additional symptoms commonly known as non-motor symptoms. Within these, olfactory dysfunction are manifested in a high percentage of sporadic cases of PD, and appeared years before motor symptoms. Even though clinical studies have linked hyposmia with mutations in PINK1 gene, a mitochondrial kinase associated with juvenile Parkinsonism of recessive inheritance, the biological basis of this phenomenon has not yet been fully understood. This project aimed to study early olfactory alterations due to loss of function of PINK1 in a zebrafish model. It was observed that this fish line presents a significant decrease of dopaminergic neurons in the diencephalon within a few days of hatching, suggesting that olfactory alterations could manifest early. To address this possibility, we evaluated the behavioral responses of wild type and PINK1-/- mutant larvae to odorants that normally trigger aversive (cysteine) and attractive (alanine) responses. Also, we observed the early morphology and neurochemical connectivity of the olfactory bulb, focusing primarily on dopaminergic and serotonergic systems due to their role role in odorant-response modulation. Behaviorally, it was observed differences associated with age in WT and PINK1-/- larvae, which may be related to the maturation of the olfactory system. Basal behavior of PINK1-/- larvae showed signs of hyperactivity at 3, 4 and 5 days post fertilization (dpf), travelling about two times the distance compared to WT larvae. Likewise, mechanical stimulation with the odorant-free E3 medium induced an increase in the distance traveled by larvae PINK1 -/- at 3 and 4 dpf. Also, larvae PINK1-/- of 4 dpf exposed to cysteine showed a higher response than the observed in WT larvae, with an increase in swimming at high speeds (> 9 mm/s). However, larvae PINK1-/- of 3 dpf exposed to alanine did not show the increase in swimming distance or the average velocity (3-9 mm/s) observed in WT. Together, these results suggest two different phenomena: (I) there are early olfactory alterations that affect the ability of the larvae to perceive the stimulus, and (ii) a possible anxious phenotype of these larvae, indicated by the increase in the distance and swimming speed in response to an aversive stimulus. The morphological and neurochemical analysis in the olfactory bulb of WT larvae showed a proportional increase in the volume of the dG-maG, lG-dlG and vmG-vaG-vpG regions between 3 and 5 dpf. In addition, an increase in the length and distribution of the 5HT(+) innervation and in the number of TH(+) neurons in the bulb was observed, suggesting a greater participation of regulatory systems of synaptic activity in the glomerular layer. In summary, the results indicate that the PINK1-/- larvae manifest early non motor Parkinson phenotypes. On the one hand, olfactory loss and anxiety, two early symptoms that correlate in Parkinson's patients. On the other hand, the hyperactivity of the larvae may reflect a possible compensatory effect of the system before the motor symptoms manifest. Although it is necessary to confirm these observations through studies of synaptic activity in the olfactory bulb and specific behavioral analyzes for anxiety, this thesis validates the PINK1-/- line of zebrafish as an excellent model for early stage PD research.