Detección de genes sul Y dfr en plásmidos de cepas chilenas de Shigella sonnei multirresistentes aisladas en período 2008-2009

Abstract

La shigelosis es una infección entérica aguda causada por serogrupos del género Shigella. El tratamiento antimicrobiano para la infección por Shigella spp. puede acortar la duración de los síntomas clínicos y reducir la propagación de la bacteria. Trimetoprim sulfametoxazol (SXT) es uno de los compuestos antimicrobianos de primera línea utilizado en el tratamiento de la shigelosis. Sin embargo, la resistencia a SXT ha aumentado significativamente en cepas de S. sonnei aisladas en Chile, desde un 50% en 1995 hasta un 100% en el 2009. Uno de los mecanismos de resistencia más importantes es la presencia de genes sul y dfr, los que codifican variantes enzimáticas de la dihidropteroato sintasa (DHPS) y dihidrofolato reductasa (DHFR), respectivamente. A la fecha se han descrito 3 alelos del gen sul y 33 alelos del gen dfr. Estos genes de resistencia pueden encontrarse en plásmidos y varían entre las cepas. En Chile, en el período estival 2008- 2009 se comunicó el surgimiento y diseminación de una cepa de S. sonnei resistente a varios antimicrobianos (ampicilina, estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina y SXT). En estas cepas los genes de resistencia sul y dfr no han sido estudiados aunque su perfil plasmidial reveló la presencia de 2 plásmidos de 3,9 y 4,8 MDa, cuyos tamaños coinciden con algunos plásmidos que contienen genes sul y dfr en otras especies y géneros bacterianos. En consecuencia, los objetivos de esta Tesis fueron: 1) detectar la presencia de los genes de resistencia a SXT (sul y dfr) en cepas de S. sonnei aisladas durante el período 2008- 2009 en Chile; 2) determinar la presencia de los genes de resistencia a SXT (sul y dfr) en el DNA plasmidial de estas cepas; 3) establecer la presencia y organización de estos genes en un plásmido de bajo tamaño molecular (3,9 o 4,8 MDa); 4) evaluar la capacidad de transferencia de este plásmido de resistencia. Para ello, se estudiaron los genes sul y dfr (3 y 17 alelos, respectivamente) por PCR, tanto en el DNA total como en el DNA plasmidial. Posteriormente, se comprobó que cepas de E. coli DH5α competentes se transformaron con el plásmido de 3,9 MDa y no con el de 4,8 MDa. El plásmido transformado fue denominado pABC-3 y se caracterizó por PCR tiling, RFLP y secuenciación. Finalmente, por conjugación, se evaluó la capacidad de pABC-3 de ser transferido a otra bacteria. Resultados: todas las cepas de S. sonnei aisladas el 2008-2009 poseen los alelos de resistencia sul2 y dfrA14. Ambos genes están codificados en un plásmido probablemente no conjugativo, pABC-3. Estos resultados, en su conjunto, sugieren que la resistencia a SXT en cepas de S. sonnei aisladas durante el brote ocurrido en los años 2008- 2009 está mediada por los alelos sul2 y dfrA14 codificados en un plásmido de 3,9 MDa probablemente no conjugativo que se denominó pABC-3. Este plásmido no ha sido descrito en Shigella spp.

Shigellosis is an acute intestinal infection caused by serogroups of the genus Shigella. Antimicrobial treatment for Shigella infection may shorten the duration of clinical symptoms and reduces the spread of the bacteria. Trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX) is one of the first-line antimicrobials used for the treatment of shigellosis. However, resistance to TMP SMX has increased significantly among Shigella sonnei strains isolated in Chile from 50% in 1995 to 100% in 2009. An important resistance mechanism to TMP-SMX involves the sul and dfr genes, encoding dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR) insensitive enzymes, respectively. To date, 3 sul gene alleles and 33 dfr gene alleles have been described. These TMP-SMX resistance genes can be coded in plasmids and vary among strains. In Chile, the emergence and spread of several multidrug-resistant strains of S. sonnei (resistant to ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, tetracycline and SXT) was reported in summer period 2008- 2009. In these strains, sul and dfr resistance genes have not been studied. Their plasmid profiles showed the presence of two plasmids of 3, 9 and 4, 8 MDa whose sizes are similar to plasmids coding sul and dfr genes that have been described in other bacterial species and genera. As a consequence, the aims of this thesis were: 1) to detect TMP SMX resistance genes (sul and dfr) in S. sonnei strains isolated during the period 2008- 2009 in Chile; 2) to determine TMP-SMX resistance genes (sul and dfr) in plasmidial DNA of these strains; 3) to establish the presence and organization of these genes into a plasmid of low molecular size (3,9 or 4,8 MDa); 4) to evaluate the ability of these plasmids to transfer themselves. For this, sul and dfr genes (3 and 17 alleles, respectively) were searched by PCR, both in total DNA and plasmid DNA. Then, competent E. coli DH5a cells were transformed chemically with the plasmid of 3,9 MDa. It was not possible to transform the E. coli DH5a with the plasmid of 4, 8 MDa. The transformed plasmid was named pABC-3 and it was characterized by PCR tiling, RFLP and sequencing. Finally, it was assessed by conjugation experiments the ability of the pABC-3 to transfer to another bacteria. Results: all of the strains of S. sonnei isolated in 2008- 2009 have the sul2 and the dfrA14 alleles. Both genes are coded in the probably non-conjugative plasmid pABC-3. Taken together, these results suggest that resistance to TMP-SMX of S. sonnei strains isolated during the 2008- 2009 Chilean shigellosis outbreak, is mediated by sul2 and dfrA14 alleles that are coded in the probably non-conjugative plasmid pABC-3 (3,9 MDa). To our knowledge, plasmid pABC-3 has not been reported previously in Shigella spp.