Evaluación de la importancia del ritmo circadiano en la regulación del proceso de división celular de Anabaena sp. PCC7120

Abstract

En cianobacterias unicelulares, se ha demostrado que el reloj circadiano influye en la temporalidad con que ocurren ciertos procesos celulares tales como la fotosíntesis, respiración celular, división celular, entre otros. Esta regulación requiere la presencia de un oscilador central KaiABC que controle el sistema junto con una serie de proteínas de detección de señal (vía de entrada) y transcripción de genes (vía de salida) que permiten finalmente predecir y anticipar cambios ambientales en la intensidad lumínica con el fin de optimizar la respuesta celular, adaptando la topología del cromosoma, transcriptoma, proteoma, metabolismo, entre otros. Estudios en cianobacterias unicelulares han mostrado un control sobre la formación del anillo Z por el oscilador KaiABC, lo cual, finalmente, determina la temporalidad de la división al impedir que ocurra durante cierto periodo. Por otro lado, los estudios en cianobacterias multicelulares son limitados, aunque hasta ahora ha sido posible identificar genes que oscilan circadianamente, entre ellos algunos específicos para heterocistos. A pesar del progreso en entender los factores que orquestan la división celular en cianobacterias, las proteínas involucradas y cómo ocurre el ensamblaje y dinámica del proceso en cianobacterias multicelulares aún se encuentra en estudio. Mas aún, la relevancia fisiológica y metabólica de la presencia de un reloj circadiano funcional y su interacción con este proceso, es totalmente desconocido. Por ello, para poder evaluar los efectos del reloj circadiano en cianobacterias filamentosas se generó y caracterizó una mutante de Anabaena sp. PCC7120 (modelo de estudio de división celular) mediante la deleción del clúster kaiABC por recombinación homóloga a través del método de conjugación triparental. La poliploidía característica de las cianobacterias hace que el proceso de obtención de una mutante completa (proceso de segregación) sea largo y complejo. Inesperadamente, durante la segregación de la mutante, se observó un fenotipo ramificado, característico de cianobacterias pertenecientes al orden Stigonematales. Al obtener el mutante completo, el fenotipo observado fue similar a la cepa silvestre, aunque las células presentan un área 54,2% mayor. El posicionamiento del anillo Z en la mutante es efectivo, ya que las divisiones ocurren de manera exitosa, a pesar de haberse observado algunas anormalidades en su localización. La tasa de crecimiento de la variedad mutante es significativamente menor de acuerdo con una prueba de Tukey (P < 0,0001), sin embargo, mediante un ANOVA de tres vías al comparar todas las variantes, las principales fuentes de variación son el fotoperiodo y la suplementación de nitrógeno. Por otro lado, la capacidad de diferenciar heterocistos estaba aún presente en la mutante ΔkaiABC, aunque se ve afectado el patrón de diferenciación, lo cual sugiere un control subyacente de la diferenciación celular por el reloj circadiano. Además, la capacidad de fijar nitrógeno fue verificada mediante el ensayo de reducción de acetileno (ARA), lo que mostró que en la variedad mutante los heterocistos eran funcionales y fijaban en tasas similares a la variedad silvestre.

In unicellular cyanobacteria has been demonstrated that the circadian clock influences the timing of certain cellular processes such as photosynthesis, cellular respiration, and cellular division. This regulation requires the presence of the central oscillator KaiABC which controls the system –along with a series of proteins involved in signal detection (input) and gene transcription (output) that allows to predict and anticipate environmental changes in light intensity to optimize the cellular response, adapting, for example, the chromosome topology, transcriptome, proteome, and metabolism. The studies on unicellular cyanobacteria have shown a control on Z-ring formation by the KaiABC oscillator, which determines the timing by gating of cell division. On the other hand, studies on multicellular cyanobacteria have been scarce, nonetheless, clock-controlled genes have been identified, some of which are specific to heterocyst. Despite progress in understanding the factors that orchestrate cellular division on cyanobacteria, the proteins that participate and how the process occurs in multicellular cyanobacteria are still unknown, and the functional clock's physiological and metabolic relevance has been underexplored. To evaluate the effects of the circadian clock in filamentous cyanobacteria, we generated and characterized a mutant of Anabaena sp. PCC7120 –a model species –by deletion of the kaiABC cluster through homologous recombination. The polyploid characteristic of filamentous cyanobacteria makes the process of mutagenesis long and complex in order to obtain a fully segregated mutant. Unexpectedly, during the segregation of the kaiABC cluster deletion mutant, it was observed a branched phenotype, characteristic of the Stigonematales order. When the segregation was complete the phenotype was morphologically similar to the wild type, although cell area increased by 54.2%. Z-ring placement results in successful divisions, despite having observed some abnormalities in its location. Mutant strain’s growth rate was significatively smaller according to a Tukey test (P < 0.0001), however, a three-way ANOVA shows that the main source of variation are photoperiod and nitrogen supplementation. The capacity to differentiate cells to heterocysts was still present in the ΔkaiABC mutant, although the patterning was somehow altered, which suggest an underlying control of cell differentiation by the circadian clock. The nitrogen fixation activity was verified with an Acetylene Reduction Assay (ARA), that showed functional heterocysts with fixation rates similar to its wild-type counterpart.