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Professor Guidedc.contributor.advisorMarcelain Cubillos, Katherine
Authordc.contributor.authorCarrero Zapata, David Andrés
Admission datedc.date.accessioned2021-10-05T21:29:46Z
Available datedc.date.available2021-10-05T21:29:46Z
Publication datedc.date.issued2015
Identifierdc.identifier.urihttps://repositorio.uchile.cl/handle/2250/182153
Abstractdc.description.abstractSki es una proteína que actúa principalmente como co-represor transcripcional, regulando negativamente la expresión de genes de respuesta en numerosas vías de señalización, incluyendo la vía de TGF-β. En los promotores de los genes blancos, Ski actúa como una proteína de andamio que permite el reclutamiento de enzimas modificadoras de la cromatina, como las desacetilasas de histonas (HDACs) y metiltransferasas de ADN. Los niveles de la proteína Ski varían en el ciclo celular, encontrándose más altos durante mitosis, sin embargo poco se conoce acerca del funcionamiento de la proteína durante esta etapa. No obstante, los antecedentes disponibles indican que Ski sería necesaria para la correcta segregación cromosómica. Es así como, Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) nulos para el gen Ski, presentan defectos en la segregación de los cromosomas durante mitosis. Al realizar un análisis detallado de la ubicación de Ski, se encontró que esta proteína se encuentra ubicada en regiones pericentroméricas en un número limitado de cromosomas, por lo que se planteó que existiría una relación funcional entre la localización de Ski en estas regiones y la segregación cromosómica. Debido a la semejanza funcional de las regiones pericentroméricas entre ratón y humano, se decidió observar si en células humanas Ski ocupa la misma localización. Se utilizó una línea de fibroblastos no transformados MRC5, en la cual se encontró la proteína Ski en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos. En humanos, en estos cromosomas se ubican las regiones organizadoras del nucléolo (regiones NOR), las cuales corresponden a genes ribosomales y parte de su maquinaria transcripcional. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la ubicación y posible asociación de Ski con la maquinaria transcripcional de los genes ribosomales en distintos tipos celulares humanos. Se evaluaron dos cultivos celulares de fibroblastos no transformados (línea celular MRC5 y un cultivo primario) y una línea celular epitelial transformada (MCF7). Para establecer la distribución de la proteína Ski con respecto al nucléolo, se realizó inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectar Ski en conjunto con el factor transcripcional UBF en núcleos interfásicos. Adicionalmente, se realizó IFI sobre placas metafásicas y se determinó si Ski se localiza en los cromosomas acrocéntricos. Debido a la dificultad técnica de obtener placas metafásicas en los fibroblastos no transformados, la relación y cuantificación entre Ski y UBF en cromosomas acrocéntricos, se determinó sólo en la línea celular MCF7. Finalmente, mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), se evaluó si Ski ocupa los promotores de los genes ribosomales en células asincrónicas y mitóticas en la línea celular MCF7. Encontramos que durante interfase, Ski se distribuye en dos patrones en el núcleo celular, colocalizando con nucléolos (con uno o más nucléolos) o no colocalizando con los nucléolos (ausente de todos los nucléolos). En los cultivos de fibroblastos, un 44,5% de los núcleos mostró Ski localizado con los nucléolos, mientras que en un 55,5% no se encontró en los nucléolos. Por otro lado, en el 100% de las células MCF7, Ski no colocalizó con ningún nucléolo. En mitosis, Ski se encontró localizado tanto en cromosomas acrocéntricos como en cromosomas no acrocéntricos, siendo la localización en los primeros independiente de la presencia de UBF. Finalmente, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina indicaron que Ski se encontraría ocupando los promotores de los genes ribosomales sólo durante mitosis. Estos resultados sugieren un posible rol de Ski en la regulación de los genes ribosomales en las regiones NOR durante mitosis. Dadas las funciones descritas para esta proteína, es posible proponer que Ski sería necesaria para regular transcripcionalmente estas regiones, controlando la expresión de los genes ribosomales posterior a la mitosis. Futuros análisis se necesitan para evaluar esta hipótesis.es_ES
Abstractdc.description.abstractSki protein acts mainly as a transcriptional co-repressor, repressing gene expression in numerous signaling pathways, including TGF-β. Ski acts as a scaffold protein that allows the recruitment of chromatin-remodeling enzymes, such as histone deacetylases (HDACs) and DNA methyltransferases, to the promoters of target genes. Ski expression varies through cell cycle reaching the highest levels during mitosis, however little is known about the functioning of the protein during this stage. Nevertheless, the available data indicate that Ski would be required for proper chromosome segregation. Ski-null mouse embryonic fibroblasts (MEF), display defective chromosomes segregation during mitosis. Ski is located at the pericentromeric regions of a limited number of chromosomes, suggesting a functional relationship between the location of Ski in these regions and chromosome segregation. Because of the functional similarity of the pericentromeric regions between mouse and human, it was decided to assess if Ski occupies the same location in human cells. Thus, we evaluated localization of Ski in a non-transformed human fibroblast cell line (MRC5). In this cells, the protein was found at the pericentromeric regions of acrocentics chromosomes. In humans, these type of chromosomes, contain nucleolus organizer regions (NOR regions), corresponding to ribosomal genes and the associated transcriptional machinery. In this study, we evaluated the localization of Ski and its possible association with the transcriptional machinery of ribosomal genes in different human cell types. We assessed two non-transformed fibroblasts (MRC5 cell line and a primary culture) and a transformed epithelial cell line (MCF7). To establish Ski distribution regarding to nucleolus, we performed indirect immunofluorescence (IFI) for detection of Ski and transcriptional factor UBF in interphase nuclei. Additionally, when IFI were performed on metaphase spreads, localization of Ski at acrocentic chromosomes was evidenced. Colocalization of Ski and UBF at acrocentric chromosomes was determined in MCF7 cells. Finally, by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), we assessed whether Ski occupied ribosomal genes promoters in asynchronous and mitotic MCF7 cells. We found that during interphase, Ski shows two distinct patterns: Ski colocalization with one or more nucleoli or Ski absent in all nucleoli. In fibroblast lineage, 44.5% of nuclei had Ski localized in nucleoli, while in 55.5%, the protein was not found in the nucleoli. On the other hand, in 100% of MCF7 cells, Ski was not colocalized in the nucleoli. During mitosis, Ski was found in acrocentric and no acrocentric chromosomes in MCF7 cells. In acrocentric chromosomes, Ski localization was independent of the presence of UBF. Finally, chromatin immunoprecipitation assays showed that Ski is occupying the promoters of the ribosomal genes only during mitosis. Given the functions described for Ski, it is possible to propose that this protein would be needed to maintain epigenetic information in these regions, controlling expression of ribosomal genes in the following interphase. Further analyses are needed to evaluate this hypothesis.es_ES
Patrocinadordc.description.sponsorshipEsta tesis fue financiada por: el proyecto FONDECYT regular #1151435.es_ES
Lenguagedc.language.isoeses_ES
Publisherdc.publisherUniversidad de Chilees_ES
Type of licensedc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States*
Link to Licensedc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/*
Keywordsdc.subjectProteínas de unión al ADN - Genéticaes_ES
Keywordsdc.subjectProteínas proto-oncogénicas - Genéticaes_ES
Keywordsdc.subjectTranscripción genéticaes_ES
Keywordsdc.subjectRegión organizadora del nucléoloes_ES
Keywordsdc.subjectADN ribosómico - Genéticaes_ES
Títulodc.titleEstudio de la localización de la proteína SKI en nucléolos y regiones NOR en células humanases_ES
Document typedc.typeTesises_ES
dc.description.versiondc.description.versionVersión original del autores_ES
dcterms.accessRightsdcterms.accessRightsAcceso abiertoes_ES
Catalogueruchile.catalogadorprves_ES
Departmentuchile.departamentoEscuela de Postgradoes_ES
Facultyuchile.facultadFacultad de Medicinaes_ES
uchile.gradoacademicouchile.gradoacademicoMagisteres_ES
uchile.notadetesisuchile.notadetesisTesis para optar al grado de Magíster en Genéticaes_ES


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