Estudio del efecto del ácido betulínico en la apoptosis en espermatozoides mótiles de individuos con espermiograma normal

Abstract

La infertilidad constituye un problema de salud pública mundial que afecta alrededor del 15% de las parejas y cuya incidencia va en aumento. Estudios en el semen han demostrado una disminución significativa en la motilidad espermática, aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs) y aumento de marcadores apoptóticos durante la última década en pacientes infértiles. Diversos mecanismos desencadenan el proceso apoptótico en espermatozoides, entre ellos el aumento de calcio intracelular (iCa2+), la generación de EROs mitocondriales, y compuestos naturales exógenos como el ácido Betulínico (AB). Se ha reportado que en líneas celulares AB induce apoptosis directamente, vía formación del poro de transición mitocondrial (PTM), que se asocia además con un aumento de EROs y de la concentración de iCa2+. En espermatozoides eyaculados humanos tratados con AB se ha observado un aumento de caspasa-3 activa (Cas-3), disminución del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨM) y disminución de la motilidad progresiva. Sin embargo, el mecanismo celular por el cual AB, un potencial candidato para terapias anticancerígenas, induce un aumento de marcadores apoptóticos en espermatozoides no ha sido estudiado. El presente trabajo se enfoca en estudiar si la apoptosis y disminución de la motilidad espermática generados por AB se previenen mediante el uso de agentes antioxidantes, quelantes de iCa2+ o inhibidores de la formación del poro mitocondrial (PTM) en espermatozoides mótiles de individuos con espermiograma normal. Espermatozoides mótiles provenientes de semen de sujetos con espermiograma normal que consultaron en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile fueron tratados con distintas concentraciones de AB y se midieron diferentes marcadores apoptóticos en el tiempo como: Cas-3, Fosfatidilserina (FS), ΔΨM y motilidad espermática, utilizando microscopía de fluorescencia y técnicas de procesamiento de imágenes digitales. Por otro lado, espermatozoides mótiles fueron pre-tratados con N-acetilcisteína (NAC, antioxidante), BAPTA-AM (quelante de iCa2+) y CsA (Ciclosporina A, inhibidor de formación de PTM) previo a la incubación con AB. Los resultados muestran un aumento significativo en el tiempo (0 a 30min) de los marcadores apoptóticos, de manera dosis-dependiente en respuesta a AB. El uso de antioxidantes como NAC protege a los espermatozoides del aumento de Cas-3 y de la disminución de la motilidad espermática progresiva inducida por AB. Por otro lado, el uso de BAPTA-AM protege a los espermatozoides sólo de la disminución de la motilidad inducida por AB, mientras la participación de la formación del PTM en la disminución de la motilidad inducida por AB fue confirmada. Los hallazgos de este proyecto contribuyen a esclarecer la dinámica temporal de los eventos apoptóticos inducidos por AB, junto con el mecanismo por el cual una droga anticancerígena induce apoptosis en células germinales, siendo el aumento de EROs y formación del PTM los principales mecanismos responsables. En otro contexto, los resultados proporcionan evidencias de que los espermatozoides son susceptibles a iniciar el proceso de muerte celular programada post-eyaculación, además de aportar evidencias sobre un mecanismo fisiopatológico que permite explicar el aumento de apoptosis observada en una fracción de la población de sujetos infértiles.

Infertility is a global public health problem that affects about 15% of couples and shows a tendency towards increasing. During the last decade, the sperm of infertile men have shown decreased sperm motility, increased reactive oxygen species (ROS) and increased apoptotic markers. Various mechanisms trigger the apoptotic process in sperm, including increasing intracellular calcium (iCa2+), mitochondrial ROS generation and exogenous natural compounds such as betulinic acid (BA). In cell lines it has been reported that BA induces apoptosis directly by generation of the mitochondrial transition pore (MTP), and BA has also been associated with increased ROS and iCa2+ levels. In human ejaculated sperm treated with BA, increased active Caspase-3 (Cas -3), decreased mitochondrial membrane potential (ΔΨM) and decreased sperm motility have been observed. However, the cellular mechanism by which AB induces an increase of the apoptotic markers in sperm has not been studied. The present work focuses on study whether apoptosis and decreased spermatic motility generated by BA are prevented by antioxidants, intracellular calcium chelators and inhibition of the MTP formation in motile sperm from normal semen analysis. Motile sperm samples from normal semen analysis subjects from the Clinical Hospital from the University of Chile were treated with different concentrations of BA and different apoptotic markers were measured in time-lapse experiments: Cas-3, Phosphatidylserine (AV) , ΔΨM (JC-1) and motility, using fluorescence microscopy and digital image processing techniques. Motile sperm were pre-treated with N-acetylcysteine (NAC, antioxidant), BAPTA-AM, chelator iCa2+ and CsA (Cyclosporine A, inhibitor MTP formation). The results show a significant increase of the apoptotic markers through time, in a dose dependent response to AB. The usage of antioxidants such as NAC protects the sperm from the increase of Cas-3 and the decreased sperm motility induced by AB. Furthermore, the use of BAPTA-AM only protects sperm from the reduced motility induced by AB, while the participation of MTP formation on the decrease motility induced AB was confirmed. The findings of this project help to clarify the temporal dynamics of the apoptotic events induced by AB, together with the mechanism by which BA induces apoptosis in sperm being the increasing ROS and MTP formation the main responsible mechanisms. In addition, the results provide evidence that the sperm are susceptible to starting the process of programmed cell death post-ejaculation. Finally, this work provides evidence of a pathophysiological mechanism to explain the increased apoptosis observed in part of the population of infertile men.