Estudio del mecanismo de inserción, orientación y dinámica del péptido penetrador TP1 actuando sobre un nuevo mimético de membrana

Abstract

Atravesar la membrana celular es una de las principales barreras en el desarrollo de nuevos fármacos, como respuesta se han propuesto múltiples soluciones para ingresar exógenos al contenido intracelular, una de estas soluciones es el uso de péptidos penetradores de célula o CPP por sus siglas en inglés. Los CPPs consisten en péptidos cortos capaces de cruzar la membrana con un cargo adherido, pudiendo ser este cargo una molécula pequeña, un péptido o material genético entre otros. Hasta hace pocos años, solo se habían desarrollado CPPs capaces de atravesar la membrana vía endocitosis, dejando como consecuencia el cargo y el CPP atrapados dentro de un endocito o vesícula. El desarrollo de CPPs apolares surgió como solución a este problema, cuya principal característica es que son capaces de ingresar al contenido intracelular mediante una translocación directa, es decir, su mecanismo de ingreso no implica la formación de vesículas. Uno de los CPPs polares descubiertos, acuñado TP1, demostró ser capaz de atravesar membranas in vivo y membranas artificiales con la misma eficiencia, implicando que su mecanismo de ingreso no depende de procesos activos ni receptores específicos. Si bien se sospecha que el mecanismo de ingreso principal podría ser mediante difusión pasiva, hasta ahora no existen pruebas que corroboren esta conjetura. La investigación detallada en este documento, busca aportar evidencias hacia la teoría de que la translocación ocurre mediante difusión pasiva. En primer lugar, se desarrolló un mimético de membrana a base del detergente dodecilsulfato sódico y con alto contenido de fosfolípidos naturales. Este mimético tiene la característica de poder orientarse frente a un campo magnético externo; esta propiedad es especialmente útil en resonancia magnética nuclear de deuterio (2H-RMN), pues permite conocer la localización y dinámica orientacional de una sonda deuterada a partir del conocimiento de los desdoblamientos cuadrupolares. Este nuevo mimético de la membrana celular fue validado como tal al lograr reproducir las propiedades de permeabilidad de benzocaína y levodopa en el mimético. Adicionalmente, se calibró un modelo de simulación, capaz de reproducir resultados experimentales de espectroscopía del mimético de membrana. En una segunda parte, y empleando el modelo de simulación ya calibrado, se estudió el mecanismo de translocación paso a paso del péptido TP1, se exploró el mecanismo cuando la bicapa lipídica posee fosfolípidos en su composición y cuando carece de ellos. Se encontró que la translocación es más cinéticamente factible cuando el péptido tranloca dominios carentes de fosfolípidos, como lo sería una balsa lipídica. Además, se encontró evidencia de una fuerte interacción entre la arginina del péptido TP1 y los fosfatos del fosfolípido de la bicapa. Luego, en un estudio con péptidos TP1 con marcas deuteradas en sus leucinas, se logró establecer que en la conformación más probable, el péptido TP1 en equilibrio se encuentra parcialmente inmerso en la transmembrana, resultado que coincide con lo encontrado en la simulación del mecanismo y lo encontrado mediante microscopía de fluorescencia por otros investigadores.

Crossing the cellular membrane is one of the main barrier in drug discovery, many solutions have been proposed to integrate exogenes into the intracell fluid, one of these solutions is the use of cell penetrating peptides (CPP) These CPPs consist in short peptides able to cross the cellular membrane carrying a cargo, this cargo being either a small molecule, a short peptide, genetic material among others. Until few years ago, only CPPs able to cross the membrane via endocytosis had been developed. This method has the unfortunate consequence of leaving the cargo entrapped inside an endocyte or vesicle. The development of hydrophobic CPPs originated as a solution to this problem, these hydrophobic CPPs are able to translocate directly without the formation of any vesicle. One of the discovered hydrophobic CPPs, is TP1 (Translocating peptide-1), which demonstrated being able to cross in vivo and artificial membranes with efficiency alike, implying that its mechanism does not require any active process or specific receptor. While it is suspected that a passive diffusion could be the translocating mechanism this CPP employs, there is not evidence that support this conjecture. The research detailed in this document, seeks to contribute with evidence towards the theory that this CPP translocates via passive diffusion. In a first part of the research, a membrane mimetic based of sodium dodecylsulphate and a high natural phospholipid content was developed. Among many, this mimetic has the characteristic of being able to orient itself when exposed to an external magnetic field; this property is specially useful in deuterium nuclear resonance spectroscopy (2H-NMR), as it allows us to probe the position and orientational dynamics of a deuterium-labeled species from the quadrupolar splitting this spectroscopy produces. This new mimetic of the cellular membrane was validated as such by reproducing the permability properties of the drugs: benzocaine and levodopa in the proposed mimetic. The results were the ones expected as if they were performed on a cellular membrane. In a second part of the research, a step-by-step mechanism of the TP1 peptide translocating the membrane mimetic was studied, two possible mechanisms were explored in detail, one where the membrane was rich in phospholipids and another where the membrane was devoid of it. It was found that the translocation is kinetically more viable through a bilayer with less phospholipid content, as it would be a lipid raft. Furthermore, evidence was found of a strong interaction between arginine of TP1 and phosphate groups in phospholipids. Additionally, in a study with TP1 synthesized with deuterium labeled leucines, it was established that the most probable configuration of TP1 in equilibrium, is with the peptide partially immersed in the membrane. This last result concurs with what was found in the simulated mechanism, and the observed via fluorescence microscopy by other researchers.