Identificación de factores del hospedero y del agante relacionados con sus susceptibilidad y severidad en infección entérica por norovirus en niños <1 año de la Región Metropolitana

Abstract

Introducción: Norovirus (Nv) es causa importante de gastroenteritis (GE) endémica infantil. Estudios recientes sugieren que su frecuencia podría llegar a 20-25% de las GE en <5 años en algunas regiones de nuestro país. Las infecciones entéricas (IE) por este agente tienen un amplio rango de severidad, desde la excreción asintomática hasta GE con deshidratación severa. Estudios con voluntarios adultos y en situación de brotes sugieren que algunos individuos serían resistentes a la infección. No está totalmente dilucidada la razón por la que existen diferencias de susceptibilidad y severidad en los cuadros clínicos. Estudios in vitro con saliva humana y oligosacáridos sintéticos han demostrado la interacción de proteínas de la cápside de Nv con antígenos tipo grupo histosanguíneo ABO-Lewis, que se encuentran presentes en secreciones, epitelios de mucosas y glóbulos rojos, y cuya expresión depende de la actividad de las enzimas FUT2, FUT3 y ABO. Si bien la unión in vitro se ha demostrado para todos los genogrupos de Nv, su efecto in vivo ha sido menos consistente. Se ha descrito, en particular para el genogrupo I (GI) de Nv, que individuos “secretores” grupo O, que poseen antígeno H y Lewis b en secreciones y carecen de antígenos A y B, serían más susceptibles, mientras que los sujetos “no secretores” (sin antígeno H ni Lewis b en secreciones) serían “naturalmente resistentes” a la infección. No está claro si estos antígenos tienen alguna relevancia en la susceptibilidad frente a la IE por Nv en niños y si es válida para GII que es el predominante a nivel mundial. La variedad de expresión clínica sugiere que además de la sola presencia o ausencia de receptores debe haber otros factores relacionados con severidad. Estos factores podrían incluir el sistema inmune innato (polimorfismos de FUT2, FUT3 y ABO que modificarían su actividad y por ende la síntesis de antígenos histosanguíneos), la inmunidad adquirida (anticuerpos de mucosas) y/o variantes del agente que pudieran ser más virulentas. Las hipótesis planteadas fueron: 1) Los lactantes con fenotipo “Secretor”, particularmente aquellos con grupo histosanguíneo O, A y AB tendrían mayor probabilidad de adquirir una infección por Nv durante su primer año de vida que los individuos grupo B (susceptibilidad) y los “No Secretores”. 2) La severidad del cuadro clínico en este grupo de estudio estaría determinada fundamentalmente por factores del hospedero relacionados con variantes de las enzimas involucradas en la síntesis de antígenos histosanguíneos ABO-Lewis y/o con inmunidad adquirida humoral de mucosas (tanto la transmitida a través de la leche materna (LM) como la producida por el propio lactante) y no dependería de la variante viral involucrada. Los objetivos de este trabajo fueron: 1) Determinar la relación entre susceptibilidad frente a IE por Nv en niños ≤1 año de la Región Metropolitana (RM) y factores del hospedero (fenotipo/genotipo Secretor); 2) Establecer la relación entre severidad del cuadro clínico y factores del hospedero: a) inmunidad innata (fenotipo ABO, polimorfismos FUT2, FUT3 y ABO en lactantes y fenotipo histosanguíneo en LM); b) inmunidad adquirida (presencia de IgA anti-Nv previo al episodio) y factores del virus: a) genotipo viral; b) tipos de residuos ubicados en la porción más expuesta de la cápside viral. Metodología: Se implementó un modelo de cohorte de lactantes atendidos en 2 consultorios de la RM. Se realizaron controles de salud mensuales hasta los 12 meses y durante los episodios de GE. En los controles sanos se consultó acerca de síntomas gastrointestinales durante el último mes y en los episodios de diarrea se evaluó la severidad del cuadro con score clínico validado. En cada control se tomaron muestras de deposición en busca de Nv (ELISA y RT-PCR). Durante el seguimiento se tomaron muestra de saliva y LM (en aquellos que recibieron lactancia materna hasta al menos los 6 meses). En las muestras de deposición Nv (+) se estudiaron: 1) el genotipo de acuerdo a la secuencia de una región conservada del gen de la cápside; 2) los aminoácidos de la región más expuesta de la cápside mediante el “Método de huella evolutiva” buscando residuos potencialmente relevantes en la interacción con sus receptores. En los pacientes Nv (+) se estudiaron: 1) fenotipo histosanguíneo en saliva (ELISA), 2) genotipo FUT2, FUT3 y ABO, y 3) presencia de IgA anti-Nv (ELISA). En las madres se determinó: 1) fenotipo histosanguíneo en saliva y LM (ELISA) y 2) presencia de IgA en LM (ELISA). Para el análisis de factores de severidad, en los casos en que no se contó con número suficiente de GE por este modelo, se incluyeron lactantes ≤12 meses con GE por Nv reclutados por el mismo grupo de investigadores en un estudio paralelo de diarrea endémica realizado en 2 hospitales de la RM y de Valparaíso respectivamente. Resultados: Se reclutaron 246 niños, de los cuales 166 (67%) fueron incluidos en el análisis final (tuvieron al menos 8 muestras durante el año de seguimiento). Se detectaron 154 infecciones asintomáticas (98 lactantes) y 24 gastroenteritis (22 lactantes) por Nv, siendo este agente la primera causa de diarrea en esta cohorte (23,3% de los GE). En 39 lactantes se detectó Nv asintomático en >1 oportunidad. Se realizó estudio de fenotipo/genotipo Secretor en 121/166 lactantes, incluyendo 73/98 niños con infección asintomática y 16/22 con GE por Nv. La frecuencia de fenotipo/genotipo “Secretor” fue significativamente mayor en los lactantes con infección por Nv comparado con los no infectados, constituyendo un factor de susceptibilidad (7/81 y 10/40 lactantes respectivamente; p=0,03). No se encontraron diferencias en susceptibilidad entre los grupos ABO. Respecto a severidad, se encontró una menor proporción de GE en lactantes Nv(+) que recibieron leche de madres “Secretoras” (versus madres “No Secretoras”) y LM con IgA anti virus México (p=0,036 y 0,04 respectivamente). Se encontró una tendencia hacia una mayor proporción de lactantes heterocigotos para polimorfismos del gen FUT3 y menor proporción de individuos con IgA previa al episodio en lactantes con GE por Nv versus asintomáticos, diferencias que no alcanzaron significancia estadística (p=0,11 y 0,25 respectivamente). No se encontraron diferencias entre pacientes con distinta presentación clínica en cuanto a la distribución de fenotipo ABO ni SNPs de FUT2. GII.4 fue por lejos la variante viral predominante, siendo significativamente más frecuente en GE respecto a infección asintomática (p=0,035). La mayoría (87%) de las secuencias de GE pertenecientes a GII.4 tuvieron 100% de identidad con la variante de referencia GII.4 2006b, predominante a nivel mundial al momento de realización del estudio, mientras que sólo 50% de las secuencias asintomáticas clasificadas como GII.4 se agruparon en este cluster (p=0,02). Mediante herramientas de bioinformática se pudieron encontrar diferencias aminoacídicas a nivel del sitio de unión a grupo histosanguíneo entre las secuencias de cápside de Nv locales respecto a secuencias de referencia. Discusión y conclusiones: Nv fue la principal causa de GE en esta cohorte y se encontró una alta proporción de lactantes con infecciones asintomáticas, mayor a lo descrito previamente en la literatura. El fenotipo “No Secretor” fue un factor protector significativo, lo que concuerda con lo descrito previamente en adultos, sin embargo, esta protección no fue completa, lo que resulta novedoso y sugiere la posibilidad de receptores alternativos a los antígenos histosanguíneos. La severidad de los cuadros clínicos estuvo determinada por factores del hospedero y del agente. La LM de madres secretoras, resultó ser un factor protector, lo que sugiere que los antígenos histosanguíneos solubles podrían interferir en la interacción del virus con su receptor de mucosa. Esto resulta relevante por la posibilidad de diseñar fármacos antivirales que pudieran actuar por este mecanismo. La presencia de anticuerpos en LM frente a algunos genotipos virales también fue protector frente a cuadros sintomáticos. Considerando el eventual uso de vacunas contra Nv en un futuro próximo, sería deseable continuar los estudios en esta línea, explorando más profundamente el efecto de la presencia de anticuerpos en severidad y evaluando específicamente la presencia de anticuerpos anti-GII.4 (no evaluado en este estudio), que fue el tipo viral más frecuente y los títulos de anticuerpos que pudieran asociarse a protección. GII.4 fue la variante viral predominante, similar a lo descrito en otras latitudes. La mayor proporción de GII.4 en individuos con GE versus asintomáticos y la agrupación diferenciada dentro del genotipo GII.4 de los virus que produjeron infección con y sin síntomas, sugiere la existencia de variantes más virulentas, lo que resulta novedoso en este campo de estudio. Las variaciones encontradas mediante herramientas de bioinformática a nivel del sitio de unión de la cápside viral a antígenos de grupo histosanguíneo podrían explicar al menos en parte la capacidad de la variante local de afectar también a individuos “No Secretores”. Finalmente, estudios de este tipo, que intenten integrar factores del hospedero y del agente al momento de explicar el resultado de esta interacción (cuadro clínico), permitirían comprender de un modo más dinámico y real los mecanismos de enfermedad en enfermedades infecciosas.

Introduction: Norovirus (Nv) are important cause of endemic gastroenteritis (GE) in children, representing up to 25 % of the GE in children <5 years in some regions of our country. Studies with adult volunteers and outbreaks settings suggest that some individuals would be resistant to this infection. Enteric infections by this agent have a wide spectrum of clinical presentation (from asymptomatic to GE with severe dehydration). Reasons for these differences on susceptibility and severity have not been completely elucidated. In vitro and in vivo studies have suggest that histoblood group antigen oligosaccharides (ABOLewis) are the host receptor for Nv. Adult volunteer studies suggest that individuals lacking this antigens in secretions, named “Non Secretor”, are resistant to at least some genogroups of Nv. By the other hand, “Secretor”-group O individuals seems to be more susceptible to genogroup I (GI) Nv. It is not clear if these antigens are relevant for susceptibility against Nv infection in children and if it is valid for GII, the predominant genogroup worldwide. The wide spectrum of clinical presentation suggests that other factors besides presence or absence of host receptors would be participating. These severity factors might involve innate immune system (polimorphysms of the enzymes that participate in histoblood group antigen synthesis), acquired immunity (specific IgA) and/or potentially more virulent Nv strains. We hypothesized: 1) Infants with “Secretor” phenotype, particularly those group O, A and AB are more susceptible to Nv infection than individuals group B and “Non Secretores”. 2) Severity is determined mainly by host factors (haplotypes of enzymes involved in histoblood group antigens sintesis and/or IgA presence in infant sera or breast milk) and it is not related to viral strain. The aims of this research were: 1) To determine the relationship between susceptibility against Nv infection in infants of the Metropolitan Region (MR) and host factors (Secretor phenotype/ genotype); 2) To establish the relationship between severity, host factors: a) innate immunity (ABO phenotype, FUT2, FUT3 and ABO polymorphisms in infants and Secretor phenotype in breast milk); b) acquired immunity (pre-infection anti-Nv IgA presence) and viral factors: a) viral genotype; b) types of residues located in the most exposed portion of the viral cápside. Methodology: a cohort model was implemented in 2 primary health care facilities of the MR. Newborns were recruited and followed monthly up to 12 months of age. Additional checkups were scheduled in GE episodes when severity was determined by a clinical score. In every healthy or GE checkup stool samples were taken for Nv detection (by ELISA and/or RT-PCR). Saliva (in all infants) and breast milk (only in those fed with breast milk at least up to 6 months) were also requested during the follow up. In Nv (+) samples there were determined: 1) viral genotype; 2) amino acid composition of the most exposed region of the capsid by using the evolutionary trace method, looking for residues potentially relevant for host receptor interaction. Infants were studied for: 1) histoblood phenotype in saliva (by ELISA), 2) FUT2, FUT3 and ABO polymorphisms (by PCR), and 3) presence of anti-Nv IgA (ELISA). Histoblood phenotype and anti-Nv IgA was also determined in breast milk. In the cases where the number of GE episodes were less than those necessary for statistics analysis on severity factors, infants with Nv infection recruited in a parallel study of endemic GE developed by the same group of researchers were included. Results: 246 newborns were recruited and followed up to 12 months, of which 166 (67 %) were included in the final analysis (because they have at least 8 samples during the follow-up). There were detected 154 asymptomatic infections (98 infants) and 24 GE (22 infants) by Nv, being this agent the first cause of GE in this cohort (23,3 % of episodes). Nv was detected in >1 asymptomatic samples in 39 infants. Secretor phenotype/genotype was performed in 121/166 infants, including 73/98 children with asymptomatic infection and 16/22 with GE by Nv. “Secretor” phenotype/genotype was significantly more frequent in infants with Nv infection than in non infected children (7/81 and 10/40 infants respectively; p=0,03). There was no difference in susceptibility for ABO phenotype. With regard to severity, symptomatic cases were less frequent in infants fed by breast milk from “Secretor” mothers (versus “Non Secretor” mothers) and breast milk with anti-Mexico virus IgA (p=0,036 and 0,04 respectively). There was a trend to a higher frequency of symptomatic cases in infants heterozygous for FUT3 SNPs and absence of seric anti-Nv IgA, however, these diffrences were non statistically significant (p=0,11 and 0,25 respectively). There were no significant differences in clinical presentation according to ABO or FUT2 genotype. GII.4 was for far the predominant Nv genotype, being significantly more frequent in GE than in asymptomatic episodes (p=0,035). Most of GII.4 GE sequences (87 %) showed 100 % identity with the reference sequence GII.4 2006b, that was predominant worldwide during the period study, while only 50% of the GII.4 asymptomatic sequences were classified in this genetic cluster (2006b) (p=0,02). There were identified potentially relevant residues of Nv capsid protein, located close to the interaction pocket with histoblood antigens, through bioinformatics tools. Discussion and conclusions: Nv was the main cause of GE in this cohort and the frequence of asymptomatic infection was higher than previously described. “Non Secretor” phenotype was a significant protective factor against Nv infection, similar as was previously described in adults. However, this protection was not complete and it suggests the possibility of alternative host receptors. With regard to severity, breastfeeding from “Secretor” mothers amd the presence of anti-Nv IgA in breast milk were protective factors against symptomatic infection. These findings suggest that soluble histoblood group antigens and IgA might interfere the interaction between Nv and its host receptor, opening the possibility towards the development of antiviral drugs and/or vaccines acting through this mechanism. There was only a trend towards protection from symptoms in children with seric anti-Nv IgA, without statistical significance. It would be desirable to continue the study in this area, specially the determination of anti-GII.4 IgA (the predominant viral strain), considering the current development of vaccines against this agent. GII.4 was the predominant genotype similar to that described in other latitudes. It was remarkably and new the higher proportion of GII.4 in symptomatic individuals (versus asymptomatic) and the clustering of sequences associated to more severe cases in a different group from asymptomatic sequences, suggests different biological behavior inside the same genotype and the existence of potentially more virulent strains. Differences in aminoacidic composition of the capsid of local sequences, especially near to the binding pocket, comparing to reference sequences, might explain at least partly the ability of the local strains to infect also “Non Secretor” individuals. The results of these thesis underline the interplay of host and viral factors that finally determine susceptibility and severity of infections in an individual.